S1核酸酶突变检测法的优化

优化了S1核酸酶突变检测体系,结果表明(1)扩增法比杂交法产生异源双链DNA更节省时间;(2)PCR产物可以直接作为突变检测的底物;(3)适当降低反应温度、适当增加反应缓冲液中的NaCl浓度、适当缩短反应时间可提高突变检测效果。

基于分子信标和S1核酸酶检测锌离子的研究

S1核酸酶是能够特异性切割核酸单链的核酸酶,对锌离子有很强的依赖性,基于这一特性,发展了一种基于分子信标和S1核酸酶的锌离子检测新方法。结果表明该方法操作简单,不需要昂贵仪器,不涉及复杂的离子载体合成,对锌离子的检测下限为120μmol/L。

富含胞嘧啶单链DNA-银纳米簇荧光探针用于S1核酸酶的灵敏检测

以富含胞嘧啶(C)的单链DNA为模板合成银纳米簇,将其作为功能化探针,建立了一种无标记荧光检测S1核酸酶的方法.S1核酸酶可以特异性识别单链DNA,在最适的酶催化反应条件下,可将其降解为单核苷酸或寡核苷酸片段.当S1核酸酶不存在时,富含C的单链DNA可以有效地合成荧光银纳米簇;当S1核酸酶存在时,单链DNA模板被特异性识别并降解,导致无法形成银纳米簇,使体系荧光信号降低.实验结果表明,银纳米簇的荧光强度随着S1核酸酶浓度的增加而降低.在优化的条件下,体系荧光信号(F/F0)与S1核酸酶的浓度在5.0×10^(-5)~4.0×10^(-3)U/μL范围内呈线性关系,检出限为2.0×10^(-6)U/μL.该荧光探针选择性好,可用于RPMI 1640细胞培养基中S1核酸酶的检测,回收率达到91.8%~109.5%.

S1核酸酶介导的功能核酸生物传感器研究进展

S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶,在最适的酶催化反应条件下,降解单链DNA或RNA,产生带5'-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。目前,基于S1核酸酶内切酶的活性,搭载不同的信号输出及扩增方式,已经构建了一系列的生物传感器,实现了对金属离子、单链核苷酸、氨基酸等物质的检测,还能应用于核酸反应体系的纯化,多元化基因文库的构建等方面。首先从结构、性质方面介绍了S1核酸酶,并对近年来基于S1核酸酶介导的、具有代表性的生物传感器的组建及应用情况进行了综述;然后主要根据所检测的靶物质不同,对S1核酸酶介导的各种传感器进行了分类介绍;最后分析了目前S1核酸酶的研究现状,并且对未来S1核酸酶介导的生物传感器的发展方向进行了展望。

S_1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。

用S_1核酸酶方法测定αAC-616晶体蛋白基因转录起始点

采用BRL提供的HeLa细胞裂解物,已知该裂解物中含有RNA聚合酶Ⅱ和其他基因转录所必需的因子和成分。当αAC-616晶体蛋白基因在该体系中发生转录产生mRNA后,即与用^(32)P标记的αAC-616晶体蛋白基因探针进行分子杂交,杂交后加入S_1核酸酶消化去掉未配对的αAC-616DNA单链,保留杂交形成的RNA-DNA双链杂交体。作含脲素的聚丙酰胺凝胶电泳,用φ_x174HeaⅢDNA作分子标准参照物,结果表明转录出来的mRNA与276个脱氧核糖核苷酸形成互补杂交链,比5′-末端标记的^(32)P-晶体蛋白基因探针为短。据此在已知的晶体蛋白基因顺序图谱上判定出αAC-616晶体蛋白基因的转录起始点位于该图谱的第398位核苷酸Adenosine,距TATA盒下游第79位(A)。并对晶体蛋白基因转录的特性进行了讨论。

共轭高分子PFP/金纳米颗粒合成及用于探测核酸酶的研究

使用共轭高分子/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物发展了S1核酸酶的一种新型检测方法,此方法利用了金良好的荧光淬灭性质和共轭高分子的信号放大特性。这种方法是由于纳米材料表面能量转移(NSET)中,能量从供体分子到纳米颗粒表面的转移遵循可预测的约为70~100 nm的距离。在此过程中,由于从共轭高分子到嵌入染料进而到金纳米颗粒表面的NSET,不存在S1核酸酶的情况下将观察不到嵌入染料的荧光信号。而存在S1核酸酶的情况下,双链DNA被切离金纳米颗粒的表面,NSET过程中断,从共轭高分子到嵌入染料高效的荧光共振能量转移所得的嵌入染料的荧光得以恢复。

蓖麻蚕rDNA转录起始区核酸酶S1的敏感位点的特征结构

曾报道,蓖麻蚕rRNA基因的非转录间隔区内有1个单链核酸酶S1的超敏感位点,它具有d(AT)_(18)的特征结构.蓖麻蚕经饥饿,再食后.发现在该S1超敏感位点的下游还存在1个敏感位点,而在饥饿的情况下,未能检测到染色质上的这个敏感位点.新确定的这个可诱导的单链核酸酶的敏感位点,它是一个d(GT)_(10)…d(AT)_(10)的特殊结构,具有易解链的特征.这个新确定的核酸酶S1的敏感点结构可能直接参与了rDNA的转录和复制的调控.

核酸酶S1介导的缺失基因探针的富集

基因组DNA的递减杂交(genomic subtaction)是根据变性的DNA双链,在一定的条件下可以复性(再结合)的特性设计的,是分离缺失或扩增DNA片段的简单而有效的方法.Lamar等率先用来克隆了人Y染色体特异的基因探针.Kunkel等和Nussbaum等分别用该方法克隆了DMD(Duchenne muscular dystrophy)和脉络膜缺损(choroidermia)座位的探针.二者都是利用了X染色体上这两种疾病座位的大片段缺失,但对于一些小范围的缺失,如小于100kb,单纯的递减杂交就难以有效地富集这种缺失的DNA.

一种新的酶切保护PCR分析方法及其在二恶英类化合物检测中的应用

背景与目的:建立一种灵敏、快速、无放射性污染的生物方法来检测环境样本中的二恶英类化合物。 材料与方法 :二恶英类化合物可以活化胞浆内芳香烃受体(AhR)使之与一段包含特定序列的双链DNA结合 ,结合的DNA因受蛋白质保护可抵抗核酸外切酶消化而保留下来 ,痕量的保留DNA通过PCR检测出来。根据此原理本研究将TCDD溶液加入到含AhR及相关蛋白的细胞溶质中 ,在体外与含二恶英反应元件的DNA作用形成二恶英_AhR_DNA复合物 ,用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶进行消化后作PCR ,通过琼脂糖电泳可以检测目的DNA是否存在 ;同时以有机溶剂DMSO设为对照。结果 :在实验组用琼脂糖电泳可以检测到期望大小片段的DNA,而对照组为阴性。结论 :该方法可作为环境样本中二恶英污染的生物检测手段 ,具有灵敏。

γ射线外照射致哺乳动物DNA单链断裂及其重接修复的研究

用核酸酶Ｓ１法研究了γ射线外照射致哺乳动物Ｃ５７小鼠离体培养的脾细胞ＤＮＡ单链断裂及其在３７℃条件下的重接修复结果表明，ＤＮＡ单链断裂数随着辐射剂量的加大而增加；在接近生理条件下，ＤＮＡ单链断裂可发生重接修复，修复过程可分为快修复期及慢修复期。