RNA干扰抑制S100A8基因表达对Hec-1B细胞凋亡及体外药敏的影响

目的:子宫内膜癌是女性生殖器最常见的恶性肿瘤之一,晚期及复发性患者预后差,对多种化疗药物耐药。本文探讨RNA干扰抑制S100A8基因表达对子宫内膜癌细胞Hec-1B凋亡及体外药敏的影响。方法:体外合成RNA干扰用S100A8siRNA,采用脂质体将S100A8siRNA转染到人子宫内膜癌细胞Hec-1B中,用RT-PCR、West-ern blot检测S100A8基因表达,TUNEL和流式细胞仪检测细胞凋亡变化,MTT法检测细胞抑制率。在转染S100A8siRNA后不同时间的Hec-1B细胞中分别加入2个浓度的顺铂,表柔比星,紫杉醇等药物,设立阴性对照,观察Hec-1B细胞体外生长的变化。结果:1)转染S100A8siRNA可抑制Hec-1B细胞的S100A8基因表达,该作用可维持10天,随着该基因表达被抑制,细胞凋亡增加,在第5天达最高峰,转染组细胞凋亡率(30.34±10.30)%,明显高于对照组(18.14±2.68)%,(P=0.01),而随着S100A8基因表达恢复,细胞凋亡率下降至转染前水平。2)Hec-1B细胞S100A8基因表达抑制后,顺铂,表柔比星,紫杉醇等药物抑制Hec-1B细胞生长作用明显增强。除40.0μmol/L表阿霉素(P=0.056)外,33.3μmol/L和66.5μmol/L顺铂,20.0μmol/L表阿霉素,5.0μmol/L和10.0μmol/L紫杉醇,与对照组比较,均显示对Hec-1B细胞生长抑制增强,存在显著差异(P<0.05)。结论:我们首次报道RNA干扰可抑制Hec-1B细胞S100A8基因表达,诱导该细胞凋亡,抑制S100A8基因表达使Hec-1B对化疗药物敏感性增加,提示该基因可能与子宫内膜癌耐药相关。

辐射诱导对小鼠巨噬细胞钙结合蛋白S100A8表达及调控影响的初步研究

目的探讨辐射诱导后小鼠巨噬细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达情况及其调控机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,按处置方法不同分为4组:A组正常培养48h;B组经10Gy射线照射后培养48h;C组用5g/ml LPS培养24h后,更换新鲜培养基继续培养24h;D组经10Gy射线照射后培养24h,然后添加5g/ml LPS继续培养24h。采用RT-PCR及定量PCR方法检测各组细胞S100A8 mRNA表达的变化。分别采用H2O2和喜树碱处理细胞,定量PCR检测S100A8 mRNA表达的变化。构建上游5′端系列报告基因表达载体并转染细胞,采用双荧光素酶法检测报告基因的表达水平。结果经γ射线或LPS刺激后,RAW264.7细胞S100A mRNA表达明显增加,二者联合作用后增加更为明显(P<0.05);H2O2处理后S100A8 mRNA表达增加,而喜树碱处理后其表达没有明显变化。单独经γ射线或LPS刺激后,报告基因的表达无明显变化,而二者联合作用后报告基因表达明显增加(P<0.05)。结论辐射诱导可促进RAW264.7细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达。

冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞钙结合蛋白S100A8和S100A9基因表达的变化

目的:探讨外周血单个核细胞钙结合蛋白S100A8和S100A9基因表达水平与冠状动脉粥样硬化的关系。方法:稳定性心绞痛(CAD)组61例:经冠状动脉造影(CAG)发现左主干有≥50%狭窄,或在左前降支、左回旋支和右冠状动脉主支发现至少有一处病变狭窄≥75%;对照组53例:有胸痛症状或有异常心电图、异常超声心动图表现,但冠状动脉造影表现为冠状动脉管壁光滑、未见明显粥样硬化斑块的患者。CAG前获得空腹静脉血进行血常规和高敏C反应蛋白(hs-CRP)检测、提取总核糖核酸并合成互补脱氧核糖核酸用于实时定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)。结果:CAD组糖尿病比例(34.4%比15.1%,P=0.032)、合并闭塞性动脉硬化和(或)缺血性脑卒中病史比例(19.7%比0%,P=0.0006)以及hs-CRP水平[0.20比0.10,P=0.022]均高于对照组。CAD组淋巴细胞百分比低于对照组(27.2%比31.7%,P=0.019)。CAD组S100A8和S100A9基因表达水平均高于对照组[分别为0.92(0.83-1.03)比0.84(0.72-0.99),P=0.028;1.09(0.91-1.41)比0.92(0.65-1.25),P=0.009]。S100A8和S100A9基因表达水平与白细胞分类计数水平均不存在相关性(均P>0.05)。糖尿病患者和无糖尿病患者的S100A8和S100A9基因表达水平无统计学意义(均P>0.05)。S100A8和S100A9基因表达水平均与hs-CRP水平相关(分别为r=0.52,P=0.0000;r=0.62,P=0.0000)。结论:稳定性心绞痛患者的外周血单个核细胞S100A8和S100A9基因表达水平升高,提示其持续高表达与冠状动脉粥样硬化有关。

利用CRISPR-Cas9技术构建S100A8基因敲除的CNE2细胞系

目的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建S100A8基因敲除的CNE2稳定细胞系。方法通过慢病毒转染,构建可以稳定表达Cas9蛋白的CNE2细胞株。针对S100A8基因作用的功能区域,设计靶向S100A8基因的g RNA,构建Lentiguide-Puro-sg重组质粒并转化stbl3感受态细胞,筛选出重组子后通过测序验证g RNA的有效性。测序鉴定后将Lentiguide-Puro-sg重组载体通过转染试剂转染CNE2细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性单克隆筛选,通过Western Blot检测S100A8基因的表达。结果测序结果显示LentiGuide-Puro-sg载体构建成功;Western Blot结果显示转染过LentiGuide-Puro-sg重组载体的细胞的S100A8不表达。结论利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了S100A8基因敲除的CNE2细胞,为后续继续研究S100A8基因在鼻咽癌细胞中的作用机制和功能奠定了基础。

人源S100A8重组质粒的构建及其对他莫昔芬治疗乳腺癌的影响

目的构建人源S1000A8的重组质粒,并在人乳腺癌细胞MCF7中表达,初步探索其对他莫昔芬处理下MCF7细胞的影响。方法设计合成针对人源S100A8基因cds区的引物序列,采用PCR的方法以人乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,扩增目的基因S100A8,经过NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后,克隆至pCMV5-myc质粒上。通过脂质体转染至MCF7细胞中,应用Western Blot法检测其蛋白表达。脂质体转染S100A8至MCF7细胞并应用他莫昔芬处理后,用MTT法检测其细胞活力,Western Blot法检测相关蛋白表达。结果酶切鉴定证明S100A8基因重组质粒构建成功,并且可以在MCF7细胞中过表达。MTT法显示S100A8可以部分逆转他莫昔芬所造成的细胞活力下降,部分抗凋亡分子表达上升。结论人源S100A8基因的重组质粒构建成功,为进一步研究S100A8在乳腺癌对他莫昔芬发生耐药的过程中的作用奠定了基础。

S100A8与辐射相关性的研究进展

S100A8钙结合蛋白是高度保守的、低分子质量的酸性蛋白，具有多种生理学功能。小鼠S100A8蛋白对于骨髓细胞是一种很强的化学诱导剂，参与众多的急性和慢性炎性反应，并与癌症的发生密切相关，S100A8基因的失活可导致胚胎死亡。在MCF-7细胞、表皮细胞以及骨髓等组织中，辐射可以诱导S100A8基因的表达，由此确定S100A8基因是新的辐射诱导基因。

单细胞RNA测序鉴定纤维化相关基因在糖尿病相关心力衰竭中的作用

研究旨在探寻糖尿病和心力衰竭之间可能存在的关联,并评估纤维化相关基因在其中发挥的作用。从GEO数据库中下载心力衰竭的单细胞测序和转录组测序数据;从CTD数据库中下载与糖尿病相关的基因;通过GO和KEGG通路富集分析寻找与糖尿病相关心力衰竭密切联系的通路;收集2017年3月—2019年3月在江苏大学附属人民医院接受治疗的心衰患者,通过实时聚合酶链反应测定关键基因的表达水平。在对数据进行标准化处理后,通过对GEO数据库的mRNA表达数据进行差异表达分析,从中获取与糖尿病相关心衰的差异表达基因。结果显示,共鉴定了206个差异表达的基因,包括94个上调的基因和112个下调的基因。同时,通过对糖尿病心力衰竭的心脏组织和非糖尿病心力衰竭患者的心脏组织进行差异表达分析,并从中获取差异表达基因。结果发现,共鉴定了265个差异表达基因,包括136个上调基因和129个下调基因。PPI网络表明,差异表达基因所编码的蛋白质彼此之间表现出强烈的内在联系。单细胞测序分析结果表明S100A8主要富集在心脏祖细胞中。最后,从之前所有的糖尿病心衰患者和非糖尿病心衰患者中随机选取5名患者进行PCR检测。结果提示糖尿病心衰患者中的S100A8的RNA相对表达水平相对于非糖尿病心衰患者显著提高。在这项研究中,作者发现S100A8通过损害心脏祖细胞与糖尿病心衰相关联,S100A8可以作为潜在的2型糖尿病引起的心力衰竭的生物标志物。