苏云金芽孢杆菌S1478-1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的Bt菌株S1478-1进行了特性鉴定,研究表明S1478-1分离株菌落形态和生长特征和Bt参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478-1分离株与其它B.thuringiensis、B.cereus和B.anthracis的16SrDNA序列相似性达到99%。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478-1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5.159×108cfu/mL。初步显示S1478-1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR-RFLP方法鉴定S1478-1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133.3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99%同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。

广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析

对广西1985-2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒（IBV）的S1基因高变区I（HVRI）进行序列测定，并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析。系统进化关系显示毒株可分为5个基因群，其中有16个广西分离株属第1群，它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高，与Massachusetts（Mass）型疫苗株的同源性较低。有15个分离株在33-34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入，GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入；GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近，同属于第Ⅱ群；GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近，属于第Ⅲ群；GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4／91亲缘关系较近，属于第V群。结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行，毒株S1基因HVRI碱基的突变或插入比较普遍，可导致其氨基酸序列的变化，绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低。同一时期的分离株同源性较高，但无明显的地域性差异。

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因5′端的变异

对自海南省、广西省发生鸡传染性支气管炎 (IB)鸡群分离的 4株 IBV分离株 (Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98、GX- 2 /98)的主要免疫原纤突蛋白 S1基因经 RT- PCR扩增其 5′端约 1.2 kb的目的片段 ,将其插入载体 p MD 18- T中 ,在大肠杆菌中实现目的基因的克隆。对克隆的目的基因经限制性酶切分析及 PCR鉴定后 ,以双脱氧链终止法测定其核苷酸序列 ,并与 Gen Bank中的参考毒株 (H12 0、SD- 1/97和 Holte)相应序列作比较 ,分析其同源性。结果表明 ,Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98及 SD- 1/97与疫苗株 H12 0的核苷酸序列同源性分别为 99.5 %、99.2 %、97.9%和99.5 % ,其推导氨基酸序列同源性分别为 99.1%、98.9%、96 .9%和 99.2 %。 GX- 2 /98与 Holte株的核苷酸序列同源率为 99.0 % ,其推导的氨基酸序列同源性为 98.6 % ,而与其他中国分离株的核苷酸序列的同源性仅为 70 %左右 ,氨基酸序列的同源性仅为 6 8%左右。

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。

IBV广东分离株GD05 S1基因的克隆、鉴定及其表达

Acording to Avian Infectious Brochitis virus( IBV) Beaudette strain S1 gene sequence, a pair of primers were designed and synthesized. With the primers , IBV Guangdong isolation strain GD05 S1 gene was successively amplified by RT-PCR.PCR product was digested with BstY I,\%Hae\% III and \%Pst\% I respectively, the result showed RFLP pattern of was the same as that of M41 S1 gene. IBV GD05 strain was thought as Mass serotype primaryly. IBV GD05 S1 gene was cloned into pGEM-T vector and sequenced, its sequence was consisted of 1611 base pairs. By comparison , the nucleotide sequence was 97.14% identical to that of IBV M41. IBV GD05 S1 gene was subcloned into expression vector pET21d. SDS-PAGE experiment showed that it expressed in \%E.coli.\%

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV793/B血清型发表的血清型特异性引物经RTPCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型。

传染性支气管炎病毒地方分离毒株S1基因的RT-PCR方法研究

以传染性支气管炎病毒 (IBV)标准毒株M41为材料 ,根据Genbank公开序列自行合成一对特异引物 ,用于扩增IBV的完整S1基因。建立了针对IBV基因组RNA特点的RT PCR方法。对反应体系中的重要反应物Mg2 +、dNTP和引物浓度进行优化 ,确定其浓度值分别为 1 5mmol/L ,2 0 0 μmol/L和 40 μmol/L。使用此反应体系对国内IBV地方分离毒株JS/95 / 0 3 ,SD/ 97/ 0 1等 10多个毒株的S1基因进行扩增 ,均扩增出预期 1 7kb的完整S1基因 。

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95 /0 3和呼吸型毒株SD/97/0 1的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定 ,将两毒株的S1基因序列与 10个参考毒株进行了比较。结果表明 ,JS/95 /0 3和SD/97/0 1分别与M41和H12 0株亲缘关系最近 ,它们可能是疫苗毒株的变异株。JS/95 /0 3和SD/97/0 1间的亲缘关系也较近 ,两者S1蛋白中只有 2 4个氨基酸的差异 ,其中有 15个位于前 130个氨基酸中 ,第 116位氨基酸可能与毒株的致病性有关。对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较 ,结果发现 。

鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析

从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、QX等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%;用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF雏鸡,对雏鸡的致死率为41.6%,感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。感染鸡从感染后第2 d开始持续向外界排毒直至感染后28 d。该研究数据表明,从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX型的IBV,该毒株对雏鸡有较强的致病作用,研究结果为了解该地区IBV的流行情况提供了参考数据。

IBV青岛腺胃分离株(SD/97/02)S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBVS1纤突蛋白基因序列 ,设计了一对引物 ,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株 (SD/ 97/ 0 2 )RNA进行RT PCR扩增。将PCR产物克隆入pMD18 T载体中进行序列测定和分析。序列分析表明 ,该毒株的S1基因的G +C %含量较少 ,为 37.0 % ,存在HindIII,BamHI,BgIII,SacI和SalI位点 ,无EcoRI位点 ,与其他毒株的同源性在 87.0 2 % 94 .2 1%之间 ,在第 15 4～ 4 2 9nt处为高度的变异区 ;将基因序列翻译成氨基酸后 ,假定的S1蛋白由 5 4 0个氨基酸组成 ,等电点 8.2 4 ,在蛋白质内部存在 18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR ,这与大多数IBV毒株 (RRF/SRR)不一样 ,有三个区域的氨基酸序列高度保守 ;16 9～ 181aa,2 30～ 2 5 0aa ,4 85～ 5 0 6aa ;与其他毒株进行抗原性比较后发现 ,在该毒株的 32 0～ 32 6aa及 390～ 4 0 1aa处的抗原表位消失 ,而在 32 5～345aa、379～ 389aa处则出现了很强的抗原表位 ;第 4 38～ 4 4 4aa处 ,其他IBV毒株 (除ZJ971株外 )原来存在的强抗原位点在本毒株中消失 ;在 5 3～ 6

PEDV变异株的分离鉴定和S1基因序列分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离株,并对其S1基因进行序列分析,本试验从江苏2个猪场发病死亡仔猪的肠道组织分离病毒,接种至Vero细胞培养;通过实时荧光定量PCR方法鉴定PEDV、反转录PCR(RT-PCR)方法对PEDV S1基因进行扩增测序;并将10^(7.0)TCID_(50)/mL的分离毒株口服接种5头哺乳仔猪(2 mL/头),观察临床症状,统计发病率和死亡率。结果显示,经鉴定获得的2株分离株均为PEDV,分别命名为DJCY株和DJYJ株。分离毒株能在Vero上产生典型细胞病变,传代至F10代时病毒滴度分别为10^(7.80)TCID_(50)/mL和10^(8.16)TCID_(50)/mL。RT-PCR鉴别诊断S1基因测序和分析显示,2株PEDV均为变异株。接种分离株的哺乳仔猪发病率为100%,接种DJCY株的死亡率为80%,接种DJYJ株的死亡率为100%。体外和体内试验证实,2株分离毒株均为PEDV变异株,且毒力较强。

鸡传染性支气管炎病毒我国地方分离株S1基因的分子特征

应用反转录 -聚合酶链式反应 ,以 IBVS1基因的特异性引物从新疆 IBV流行株基因组中扩增出预期的 1 .7kb左右的片段 ,将此PCR产物修饰后插入到克隆质粒 p UC1 9的Sma I位点 ,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。经测序及序列比较 ,与国外参考毒株相比表明新疆 IBV分离株已有分子水平的变异 ,与国内分离株 QX同源性高达 96% 。

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1基因的分离及初步鉴定

根据IBVBeaudette株全基因组序列 ,借助基因分析软件自行设计合成了 3条引物 (you1+、you2 -、youM +) ,引物you1+和you2 -在S1基因两侧 ,跨幅为 16 11bp ,引物you2 -和youM +在S1基因的 3’端 ,跨幅为 5 35bp 用引物you1+和you2 -对 5个IBV地方分离株 (HN2、HN4、JX1、SC2和SC4)进行RT PCR ,均成功地扩增出预期大小的目的片段 用另 1对引物 (you2 -和youM +)对各毒株的RT PCR产物再进行PCR扩增 ,均得到一条约 5 30bp的目的片段 ;对RT PCR产物用限制性内切酶PstⅠ进行酶切分析 ,结果酶切产物中得到 2条条带 ,大小分别为 5 6 0和 10 5 0bp ,与GeneBank中 11株已发表的S1基因分析结果一致 初步鉴定结果显示 ,已经成功分离得到了IBV S1基因 .

传染性支气管炎DN-1分离株S1基因的克隆与序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了1对引物,通过RT-PCR特异性扩增出DN-1株的S1基因,产物为1.7kb,与设计相符。同源性比较结果显示,DN-1株与H52、H120株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为99.7%、99.2%,表明IBVDN-1分离株与疫苗株的S1基因具有高度的同源性。

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因的克隆及其鉴定

用自行设计的 1对引物 you1+和 you2 -对 5个传染性支气管炎病毒 (IBV)地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC4)的基因组 RNA进行 RT- PCR,均成功地扩增出预期大小 (约 16 30 bp)的目的片段 ,经 PCR、酶切鉴定为 S1基因。将 5个毒株的 S1基因克隆到 p GEM- T载体中 ,重组质粒经 Eco R 和 Hind 单酶切以及用引物 you1+和 you2 -进行质粒 PCR扩增鉴定 ,证明 IBV- S1基因已成功地克隆到了 p GEM- T载体中。同时 ,为了测序的方便 ,还将 IBV- S1基因作了目的片段 (约 10 6 0 bp)

藏香猪源传染性胃肠炎病毒BT-1株的分离鉴定及S基因序列分析

为了鉴定藏香猪源传染性胃肠炎病毒(TGEV)BT-1株及分析S基因序列遗传特点,试验采用ST细胞培养法、RT-PCR法、直接免疫荧光(FA)试验、S基因序列分析等对从患腹泻藏香仔猪小肠内容物中分离得到的病毒株(BT-1株)进行鉴定。结果表明:BT-1株被鉴定为TGEV,大小约为1 215 bp;在荧光显微镜下,TGEV显示特异性荧光;BT-1株与SHXB株、TH-98株、 JS2012株S基因序列的同源性达100%,与Purdue株、Miller M6株、Purdue P115株等9株参考株S基因序列的同源性在97.1%~99.0%之间;BT-1株与SHXB株、TH-98株亲缘关系较最近,位于同一分支,与其他分离株亲缘较远;BT-1株S基因序列与国内分离的TGEV参考毒株序列相比,未发生明显变异。说明分离得到的TGEV BT-1株与GenBank中登录的9株TGEV参考株S基因序列的同源性较高,S基因序列未发生变异。

鸡传染性支气管炎病毒广东分离株S1基因的克隆与序列分析

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus）引起的一种急性、高度接触性传染病,主要影响呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等。各种日龄的鸡都会感染IBV,主要引起呼吸困难、肾炎、产蛋量和蛋品质的下降,IBV还可侵害肾脏、肠道、腺胃、肌肉等组织,给养禽业带来经济上的损失。