猪流行性腹泻病毒中和表位区S1D的原核表达及免疫原性分析

为了研究猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1蛋白中和表位区S1D的免疫原性,根据PEDV河南株（Gen Bank：YK649107）S1基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增S1D片段,克隆到p ET-28a（＋）中,构建原核表达载体,经优化的IPTG浓度诱导后进行SDS-PAGE分析,利用His标签的特性重组蛋白进行纯化及Western blot分析。结果显示：中和表位S1D片段在p ET-28a（＋）中高效表达;Western blot证明重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性反应;用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,抗体水平升高,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。

猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立

旨在建立一种检测黏液中猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性SIgA的ELISA方法,从而评价PEDV黏膜免疫水平。首先将PEDV的S1D基因(534~789 aa)克隆至质粒载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,其表达产物以包涵体形式存在。Western-blot验证蛋白大小为32 ku,且具有抗原活性。再以8 mol/L尿素变性蛋白,经纯化、梯度复性后作为包被抗原蛋白,通过优化条件初步建立检测鼻腔和口腔黏液中PEDV特异性SIg A抗体的间接ELISA,并确定其最佳抗原包被浓度为2μg/m L;鼻腔黏液最佳稀释度为1∶1,最佳封闭液为50 g/L脱脂乳;口腔黏液最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为30 g/L BSA;酶标抗体最佳稀释度均为1∶2 000。最后应用该方法分别检测了84份已免疫猪的口腔、鼻腔黏液,其结果与以纯化的PEDV包被的间接ELISA相比,符合率达到95.2%。本研究中建立的检测黏液中PEDV特异性SIgA的方法简便快速,具有较好的敏感性、特异性,这为评价PEDV黏膜免疫水平提供了依据和检测标准。