清疕饮调控S1P/S1PR5信号通路对HaCaT炎症模型的影响

目的通过体外实验探讨清疕饮和鞘氨醇-1-磷酸受体5(sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5)信号对鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)诱导的人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)生物学功能的影响,研究清疕饮在角质细胞(keratinocytes,KC)上对银屑病的治疗机制。方法脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)(1μg/mL,24小时)刺激HaCaT细胞,酶联免疫吸附测定实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞上清中S1P含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time-polymerase chain reaction,q-PCR)法检测S1PRs mRNA转录水平,筛选出高特异性的S1P/S1PR5通路。细胞增殖和细胞毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)法测定细胞存活率,q-PCR法检测白介素(interleukin,IL)-17、IL-23 mRNA表达,筛选适宜的S1P处理浓度和时间,蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测清疕饮对S1PR5蛋白表达的抑制,WB检测S1PR5蛋白表达筛选高效siRNA构建S1PR5基因缺陷模型。将细胞分为阴性对照组(PBS+NC siRNA)、S1P炎症模型组(S1P+PBS+NC siRNA)、清疕饮处理组(S1P+清疕饮+NC siRNA)、S1PR5基因缺陷组(S1P+PBS+S1PR5 siRNA)、清疕饮处理S1PR5基因缺陷组(S1P+清疕饮+S1PR5 siRNA)予对应处理,划痕试验检测细胞迁移率,EILSA法检测细胞上清中IL-36γ分泌,WB法检测细胞核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路相关蛋白核因子抑制蛋白(inhibitor kappa B alpha,IκBα)、kappa B抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)、磷酸化(p)-IKK、p65、p-p65的表达。结果相比于正常细胞,LPS刺激HaCaT银屑病炎症模型细胞上清S1P含量显著上升(P<0.01),S1PR5 mRNA表达增加最明显(P<0.01)。筛选出浓度0.5μmol/L的S1P处理48小时为炎症造模方案,清疕饮冻干粉溶液能显著抑制S1P造成的S1PR5蛋白高表达(P<0.01)。与阴性对照组比较,S1P炎症模型组HaCaT细胞迁移能力显著增强,上清液IL-36γ显著增加,细胞中p-IKK、p-p65蛋白的表达水平显著增加(P<0.01),IκBα、IKK、p65蛋白未发现显著变化。与S1P炎症模型组比较,清疕饮处理组、S1PR5基因缺陷组、清疕饮处理S1PR5基因缺陷组HaCaT细胞迁移能力显著降低,IL-36γ分泌量显著减少,细胞中p-IKK、p-p65表达水平显著降低(P<0.01),IκBα、IKK、p65蛋白未发现显著变化,但清疕饮处理S1PR5基因缺陷组IL-36γ、p-IKK、p-p65的变化相较于另外两组更明显(P<0.01)。结论清疕饮可以部分通过阻碍S1P与S1PR5结合抑制HaCaT细胞迁移和IL-36γ分泌,截断NF-κB通路信号,从而干预炎症反应。

S1PR5缺陷对小鼠体内淋巴细胞分布的影响

背景:鞘氨醇1磷酸受体(sphingosine 1^-phosphate(S1P)receptor,S1PR)是淋巴细胞表面一种G^-蛋白偶联受体,其配体是S1P。S1P/S1PR间的相互作用对淋巴细胞在体内的分布和迁移具有重要影响。目的:探讨S1PR5基因缺陷对体内淋巴细胞分布的影响。方法:用流式细胞术检测S1PR5基因缺陷对小鼠各组织器官中淋巴细胞亚群分布的影响。结果:与野生型小鼠相比,S1PR5缺陷小鼠的外周血(PB)和脾脏(SP)中NK细胞的比例降低(PB:6.4±0.45%vs 2.2±0.47%)(P<0.01,n=3);(SP:3.0±0.91%vs 0.68±0.14%)(P<0.05,n=3),而骨髓(BM)和淋巴结(LN)中NK细胞的比例升高(BM:0.97±0.20%vs 2.6±0.35%)(P<0.01,n=3);(LN:0.35±0.16%vs 1.7±0.15%)(P<0.01,n=3),而CD3^+T淋巴细胞在外周血、脾脏和淋巴结中的比例则无明显变化(PB:17.3±7.9%vs 17.0±4.6%)(P>0.05,n=3);(SP:33.0±6.0%vs 27.4±1.8%)(P>0.05,n=3);(LN:42.3±10.7%vs 51.2±2.7%)(P>0.05,n=3)。结论:S1PR5缺陷对小鼠体内NK细胞的分布产生重要影响。

CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除的小鼠模型,为研究鞘氨醇-1-磷酸受体5(sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5)在异基因造血干细胞移植中的作用提供实验工具。方法:根据S1PR5基因第三外显子碱基序列,设计针对S1PR5基因的sgRNA(single guide RNA),构建sgRNA表达质粒,利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6小鼠的受精卵进行显微注射。使用T7E1酶切和或基因测序检测S1PR5基因碱基的突变情况,然后应用q PCR和Western blot方法检检测S1PR5是否被成功敲除。结果:获得了2种S1PR5基因突变的F2代纯合子小鼠,即基因分别缺失170 bp和215 bp的S1PR5-170/-170小鼠和S1PR5-215/-215小鼠。在这两种小鼠中,S1PR5在mRNA和蛋白水平均没有表达。结论:成功建立了S1PR5基因敲除的小鼠模型,为探讨S1PR5在异基因造血干细胞移植的作用提供了研究平台。

基于网络药理学与肠道菌群的柏子仁脂肪油改善Aβ_(25-35)诱导小鼠脑损伤的作用研究

研究柏子仁脂肪油(Platycladi Semen oil,SP)对Aβ_(25-35)诱导小鼠脑损伤的保护作用及其机制,为临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)提供理论依据。雄性昆明(KM)小鼠随机分为对照组、模型组(脑部注射200μmol·L-1Aβ_(25-35)溶液,0.15μL·g^(-1))、阳性药多奈哌齐组(10 mg·kg^(-1))及柏子仁脂肪油低、高剂量(0.5、1 mL·kg^(-1))组。探究各组小鼠的学习记忆功能、神经元损伤、Aβ1-42/Aβ1-40、p-Tau、细胞凋亡、氧化应激相关指标、免疫细胞及鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1)/鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)/鞘氨醇-1-磷酸受体5(sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5)通路相关蛋白或mRNA水平。接着利用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析SP中的成分,并通过网络药理学、肠道菌群(gut mircrobiota,GM)16S rDNA测序及分子对接技术探讨SP干预AD的作用机制。结果显示SP可改善Aβ_(25-35)诱导小鼠的学习记忆功能,减少海马神经元损伤,降低脑内Aβ1-42/Aβ1-40、p-Tau、细胞凋亡和氧化应激相关指标的水平,并维持小鼠机体免疫细胞和GM的稳态。网络药理学和GM测序分析显示,SP对AD的治疗作用与鞘脂通路相关。同时,(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸是SP中含量最高的2种成分,与SPHK1和S1PR5有较好的结合活性。因此,推测SP通过调节肠道菌群,抑制SPHK1/S1P/S1PR5通路来发挥抗凋亡和抗氧化作用,从而改善Aβ_(25-35)诱导小鼠的脑损伤;并且(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸可能是SP发挥抗AD作用的物质基础。