预测的SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表达及其抗原性的鉴定

目的研究预测的SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表达及其模拟S2蛋白的抗原性。方法用DNAStar软件对S2亚基序列进行分析,预测B细胞表位所在肽段。通过4轮PCR反应人工搭建预测表位cDNA序列并克隆到含有伴侣10基因的pET28a(+)载体中,构成重组载体pET28-chap10-S2epi。重组蛋白Chap10-S2epi在E.coliBL21(DE3)中表达并以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。用纯化的chap10-S2epi免疫家兔制备抗血清,并通过ELISA判断Chap10-S2epi的抗原性。结果成功构建并在大肠杆菌中表达了Chap10-S2pei融合蛋白。Chap10-S2epi免疫的抗血清能识别真核细胞表达的SARS冠状病毒全长S2刺突蛋白。结论预测的SARS冠状病毒S2刺突蛋白B细胞表位肽能够诱导家兔产生针对S2蛋白的抗体,为研制抗SARS病毒基因工程疫苗奠定了基础。

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响,本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段,并分别克隆至pCAGGS载体中,构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag,均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞,48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T;利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系,并均经western blot鉴定。结果显示,上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、RRRR、SRAS和AAAA质粒分别转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot检测S蛋白的表达。将pRRAR-Flag和pFurin-His共转染HEK293T细胞;同时将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞,24 h后利用western blot检测上述两种细胞中S蛋白的表达。结果显示,转染pRRAR-Flag的细胞中检测到S蛋白和S2亚基的表达,即Furin能够切割S蛋白,但转染pAAAA-Flag和pSRAS-Flag的细胞中均检测不到S2亚基的表达,转染p RRRR-Flag的细胞中S2亚基的表达量增加。与仅转染pRRAR-Flag的对照细胞相比,在HEK293T细胞中共转染pFurin-His和pRRAR-Flag能够显著增加S蛋白切割为S2亚基的量;而在Furin-KO细胞中未检测到S2亚基的表达。采用假病毒系统包装Furin裂解位点RRAR及其突变体(SRAS、AAAA)的假病毒SARS-CoV-2;利用HEK293T和Furin-KO细胞包装SARS-CoV-2假病毒,通过计算荧光素酶活性Luc与各病毒p24蛋白含量的比值比较不同假病毒对Huh7-A+T细胞及内源性Furin对两种细胞包装的假病毒的相对感染性。结果显示,与pRRAR-Flag及HEK293T细胞包装的假病毒相比,pSRAS-Flag和pAAAA-Flag及Furin-KO细胞包装的假病毒对Huh7-A+T细胞的感染性均极显著降低(P<0.01)。将质粒pEGFP-RRAR、pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA与pEGFP-Furin分别转染HeLa细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察Furin蛋白和S蛋白在细胞中的定位;将前4种质粒与表达Furin-His的质粒共转染HeLa细胞,24 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测Furin蛋白和S蛋白及其突变体在细胞中共定位。观察结果可见,Furin蛋白主要位于细胞浆中,S蛋白与Furin裂解位点突变的S蛋白均位于细胞膜;IFA结果显示,Furin与S蛋白及Furin裂解位点突变为RRRR的S蛋白在细胞浆中均存在共定位,但与Furin裂解位点突变为AAAA的S蛋白不存在共定位。将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-m Cherry共转染HEK293T细胞,同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h后将两种细胞混合培养,24 h后观察结果显示,共转染pRRAR-Flag和pCAGGS-m Cherry的HEK293T中出现明显的合胞体,而当Furin裂解位点突变为SRAS时,合胞体的形成明显减少。本研究首次证实Furin在细胞浆中对S蛋白预切割,且将S蛋白的Furin裂解位点突变为SRAS后能够降低SARS-CoV-2的感染性和细胞合胞体的形成能力。本研究为新冠疫情的防治提供新思路。

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织20s蛋白酶体C_2亚基的基因及蛋白表达的研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子——泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达水平及意义。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定大鼠伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达。结果 RT-PCR结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达(IOD值)较对照组增加,差异有统计学意义(P<0.01);Westernblot结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达较对照组增强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 COPD大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达均显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一。

年龄相关性白内障晶状体前囊膜20s蛋白酶体α2亚基表达及意义

目的年龄相关性白内障（ARC）患者晶状体混浊程度及核的硬度与20s蛋白酶体α2亚基的蛋白表达水平及意义的关系。方法于2015年3月至2016年7月在弋矶山医院眼科收集行超声乳化或小切口白内障摘除术的前囊膜120例（核性60例，皮质性60例）。根据晶状体核的硬度及混浊程度进行分组，核性组分为A组：年轻核，B组：老核；皮质组分为A组：轻度混浊，B组：重度混浊。两种类型白内障中以A组为实验组，B组为对照组；并应用western-blot测定20s蛋白酶体α2亚基在两组ARC患者晶状体前囊膜中的表达水平。结果与A组相比较，B组20s蛋白酶体α2亚基表达水平明显降低，核性（0.99±0，02）VS（0.58±0.08）差异有统计学意义（P〈0.01），皮质性（1.26±0，15）VS（0.89±0.09）差异有统计学意义（P〈0.05）。ARC患者晶状体混浊程度及核的硬度与20s蛋白酶体α2亚基含量呈显著负相关。结论ARC患者前囊膜中20s蛋白酶体α2亚基的蛋白表达含量随晶状体混浊程度及核的硬度加深而降低。

鸡传染性支气管炎病毒组织和细胞嗜性分子机制研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的传染性支气管炎(IB)可导致鸡呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、消化系统的组织病变,不同IBV毒株的组织嗜性及相应细胞嗜性存在差异。病毒基因组上关键基因或位点通过影响病毒复制周期完整性决定组织嗜性或宿主嗜性,位于IBV S1和S2亚基上的单个或多个位点均能决定其组织嗜性和细胞嗜性,但需要进一步探究这些关键位点改变病毒与宿主互作过程的机制;其他基因对IBV组织和细胞嗜性的影响亟待研究。论文就近年来影响IBV组织和细胞嗜性差异的相关分子机制研究进展进行综述,旨在为IBV致病机制、重组疫苗、抗病毒药物等的进一步研究提供参考。

基于多重生物信息整合的类风湿关节炎寒湿痹阻证新型生物标志物的识别与验证

通过整合基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)、加权基因共表达网络分析(weighted gene correlation network analysis,WGCNA)与临床独立样本集验证,识别类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)寒湿痹阻证的新型生物标志物。首先收集临床诊断为RA寒湿痹阻证患者、RA非寒湿痹阻证患者与健康志愿者的全血样本,开展转录组测序。以RA非寒湿痹阻证患者与健康志愿者作为对照,筛选RA寒湿痹阻证的差异表达基因集;进而,开展GSEA和WGCNA的整合挖掘,获取关键差异表达基因作为该病证的候选生物标志物。再利用临床独立验证样本(每组≥10例)对上述病证候选生物标志物的表达水平进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)验证,采用受试者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲线等评价其辨证效能。研究结果显示,与健康对照组相比,获得3601个RA寒湿痹阻证相关差异表达基因(包含106个上调表达基因和3495个下调表达基因),其最显著富集于“免疫-炎症”调节、激素调节、物质和能量代谢相关通路,其次是细胞功能调控和滑膜血管翳生成相关通路等。并通过GSEA和WGCNA表明,变异系数、作用通路和生物模块代表性均排名前50%的关键差异基因ATP酶蛋白酶26S亚基2(proteasome 26S subunit,ATPase 2,PSMC2)为RA寒湿痹阻证的候选生物标志物。进一步,利用临床独立样本集的验证结果显示,PSMC2针对RA寒湿痹阻证的辨证效能参数——F1检测值、特异度、准确度、精确度分别为70.3%、61.9%、64.5%、81.3%,ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.96。综上,该研究应用“GSEA-WGCNA-验证”整合策略,识别出PSMC2为RA寒湿痹阻证的新型候选生物标志物之一,有助于提高RA核心证候的中医临床诊疗水平和辨证客观化水平。