布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞体外模型的构建

目的构建布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞的体外模型。方法布鲁菌S2株采用大豆酪蛋白培养基培养4d,通过革兰染色及柯兹罗夫斯基染色进行细菌鉴定;布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞后,通过透射电镜和胞内菌落计数观察布鲁菌进入胞内的情况;通过细胞存活率和乳酸脱氢酶活性观察布鲁菌S2株对细胞膜的影响,外设空白对照组;采用流式细胞仪观察布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞凋亡的情况,外设空白对照组。结果透射电镜显示布鲁菌S2株能够感染脑微血管内皮细胞并存在于内吞泡内,胞内菌落计数法统计细胞内菌量发现,胞内活菌量随转染时间的延长而增加(P<0.05),感染48h胞内菌落数高于12h和24h(P<0.05),感染12h和24h胞内菌落数差异无统计学意义(P>0.05);台盼蓝染色结果显示空白组与处理组间细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);在感染初期(12h前)细胞内的乳酸脱氢酶活性会增高,会对细胞膜造成损伤,在24h到48h的时候,细胞内的乳酸脱氢酶活活性较低,对细胞膜的损伤较小;流式细胞仪检测显示空白组与处理组间细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验成功构建布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞体外模型,明确了布鲁菌S2株能够进入脑微血管内皮细胞并在胞内存活。

S2株布氏杆菌减毒活疫苗免疫效果观察

2010年初,某规模养殖场奶牛群发生布氏杆菌病流行和蔓延,能繁母牛出现流产、死胎的症状。根据检疫结果对布病阳性牛隔离淘汰处理,对布病阴性牛(假定健康牛)进行免疫接种。奶牛群口服接种S2株活疫苗后15d,即可检出疫苗诱导的布氏杆菌抗体,30d抗体水平达到高峰(36%),45～90d抗体阳性率呈现缓慢下降的趋势。免疫接种能有效控制布病感染牛群流产、死胎率,减少由此导致的经济损失。本试验还对鲜乳样本中布氏杆菌核酸开展了PCR检测,对疫苗接种奶牛是否存在乳汁排菌风险进行了讨论。

布鲁菌S2株感染巨噬细胞后对小胶质细胞极化的影响

目的确定布鲁菌S2株感染巨噬细胞后对BV-2小胶质细胞极化的影响。方法用布鲁菌S2株感染RAW264.7巨噬细胞24及48h后,收集未感染巨噬细胞的上清液(COU)和感染巨噬细胞24h的上清液(COB24h)及48h的上清液(COB48h),BV-2细胞经上述上清液分别处理24h。实验分为空白对照组、COU组、COB24h组、COB48h组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态。RT-qPCR检测iNOS、TNF-α、Arg-1mRNA的表达。ELISA检测培养细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)的水平。免疫组化染色法观察iNOS蛋白的表达。结果 BV-2细胞经上清处理后,镜下观察COB24h、COB48h处理的BV-2细胞胞体变大,细胞核变大,突起较多,并较空白组伸长明显,呈长杆状。与空白对照组比较,COB24h组与COB48h组BV-2细胞iNOS及TNF-αmRNA的表达升高(P均<0.01),Arg-1 mRNA的水平降低(P<0.01),且COB48h组iNOS mRNA表达升高(P<0.01);COB24h组与COB48h组上清中TNF-α、IL-1β的含量升高(P均<0.01),COB48h处理组IL-10的含量降低(P<0.05)。免疫组化染色法观察BV-2细胞中iNOS蛋白阳性表达在胞浆中,为橙色颗粒,COB48h组胞浆中iNOS蛋白的表达高于空白对照组。结论布鲁菌S2株感染巨噬细胞后的上清液可以驱动小胶质细胞向经典激活的巨噬细胞(M1)极化。

布鲁氏菌病疫苗S2株免疫成年绵羊的抗体消长规律试验

[目的]探索成年绵羊经布鲁氏菌病疫苗S2株免疫后血清抗体的消长规律。[方法 ]采用"灌服100亿菌""灌服200亿菌"和"肌注50亿菌"三种不同免疫方法,对试验羊进行布鲁氏菌病S2株疫苗的免疫接种。在接种前和接种后不同时间点分别采集试验羊血清样品,用虎红凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)进行血清抗体检测。[结果 ]肌注组抗体上升较快,于免疫后10天达到峰值,然后快速下降,90天后下降速度减缓,但在180天时RBT和SAT阳性率仍分别为63.2%和84.2%,SAT平均凝集效价为1:178.9。2个口服组均在免疫20天后抗体达到最高,以后下降,分别于90天和120天降到最低,然后有所回升并维持在低水平波动;至180天时,口服组的RBT阳性率均下降为0,SAT阳性率分别下降为40.9%和23.1%,SAT平均凝集效价分别降至1:40.9和1:18.2。[结论 ]对采用布鲁氏菌病S2株活疫苗口服免疫6个月以后的羊群,可用虎红凝集试验进行布鲁氏菌病检疫的初筛。

S2株布鲁氏菌活疫苗免疫效果实验及防控建议

本文通过对S2株布鲁氏菌活疫苗免疫效果实验及防控建议进行了阐述,发现采用正常剂量和加强剂量免疫羊血清抗体的阳转率明显低于加倍剂量免疫羊的血清抗体的阳转率。为此在免疫的过程中要严格按照S2株布鲁氏菌活疫苗说明书进行操作,确保免疫结果达到国家要求标准,在布病防控中,各部门加强合作,坚持以人为本,加强个人防护,对患病人员积极治疗,最大限度的减轻农牧民的经济负担。

S2株、M5株布氏杆菌减毒活疫苗对山羊免疫效果比较试验

通过对36只不同日龄、不同性别的健康山羊（含妊娠母羊6只）随机平均分组，分别口服S2株、M5株布氏杆菌减毒活疫苗后，在7d、14d、21d、42d、90d对血液中布氏杆菌抗体进行检测，对S2、M5诱导的抗体消长动态进行分析及疫苗安全性评价，最终研究确定出S2可适用于不同日龄、不同性别山羊广泛使用，也适用于妊娠期间山羊的免疫，能有效预防布病的发生，减少由此导致的经济损失；M5可引起妊娠母羊免疫副反应及严重的流产症状。

羊布鲁氏菌疫苗(S2株)口服免疫试验

为了解羊只布鲁氏菌疫苗(S2株)口服免疫的安全性及免疫效果,在甘肃省平凉市2个乡镇,各选1个行政村,选择散养户饲养的264只羊作为试验羊,进行小范围的布鲁氏菌S2株活疫苗口服免疫试验,其中3月龄以上羊只(包括怀孕母羊)每只口服活菌100×2亿,3月龄以下羊每只口服活菌100亿。分别在免疫后的30、60、180、210 d,采集试验羊血清样品,采用虎红平板凝集(RBT)+试管凝集联合试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行血清抗体检测。结果显示:试验组羊只免疫后均未出现异常反应,口服免疫30 d后,试验羊只2种检测方法检测的免疫抗体阳性率分别为47.3%和53.8%,不同时间2种方法的检测结果基本一致(P>0.05)。结果表明,布鲁氏菌S2株活疫苗按照试验剂量免疫安全有效,适用于所有月龄羊只以及怀孕母羊的整群免疫,可先行试点,逐步推广应用。

布鲁氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-琼脂扩散试验方法检测评价

目的应用NH-AGID方法对布鲁氏菌M5、S2疫苗株免疫血清进行检测,评价该方法适用性。方法选取3~5月龄羔羊74只,随机分为3组。分别以S2株1.0×1010 CFU、5.0×109 CFU灌服和皮下注射接种羔羊各25只,M5株以1.0×10^(9) CFU皮下注射接种羔羊24只。免疫后7 d~150 d采集羊全血,分离血清,经RBT初筛和SAT确诊免疫抗体阳性血清。评估NH-AGID方法对M5和S2株疫苗免疫抗体与感染抗体的鉴别诊断特异性。结果NH-AGID方法对M5株疫苗免疫阳性血清的LPS抗体检出率为100%,NH抗体检出率8.3%~29.2%,鉴别诊断特异性为82.8%。对S2株疫苗口服组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为31.2%~66.7%,NH抗体检出率为0%;皮下注射组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为45.4%~100%,NH抗体检出率为4.5%~20%。对S2株疫苗免疫血清的鉴别诊断特异性为96.5%。结论NH-AGID方法不完全适用于羊用布鲁氏菌疫苗M5株和S2株的鉴别诊断,该方法的鉴别诊断特异性与疫苗毒力、免疫剂量和途径等因素相关,应进一步研究明确该方法的适用范围及条件,以期合理应用于布病防控诊断工作中。

肥大细胞对布鲁菌S_2株的模式识别及活化效应的体外研究

目的探讨体外培养的肥大细胞对猪布鲁菌S2株的模式识别及活化效应。方法骨髓来源的肥大细胞在体外感染猪布鲁菌S2株,瑞氏-姬姆萨染色法观察肥大细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色法观察肥大细胞脱颗粒情况;间接ELISA检测S2株感染后1 h和12 h肥大细胞释放组胺、IFN-γ、IL-12的含量;激光共聚焦显微镜检查肥大细胞对S2株的摄取状态;RT-PCR法观察S2株感染后12 h和24 h肥大细胞TLR4和TLR8基因的mRNA的表达;流式细胞术观察S2株感染后24 h肥大细胞TLR4和TLR8蛋白的表达。结果感染猪布鲁菌S2株的肥大细胞形态出现了明显的变化,S2株感染后1 h即出现明显的脱颗粒现象;S2株感染后1 h、12 h肥大细胞上清中组胺含量明显高于正常对照组(P<0.05),未检测到IFN-γ、IL-12;共聚焦显微镜检查发现感染30 min和1 h S2株主要黏附在肥大细胞表面,而未被肥大细胞摄入到细胞内;S2株感染12 h后肥大细胞TLR4mRNA的表达明显高于正常对照组,24 h时表达又减弱,和正常对照组相比,S2株感染24 h时肥大细胞TLR4蛋白的表达增加;S2株感染12 h和24 h后肥大细胞TLR8 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 S2株能黏附在肥大细胞的表面并能激活肥大细胞,引起其脱颗粒,释放组胺,但在实验观察的时间点内未见IFN-γ和IL-12的分泌,其机制可能是S2株通过TLR4被肥大细胞识别,但不能被肥大细胞摄取。

布鲁杆菌S2株通过JNK-p53信号通路诱导小鼠BV-2小胶质细胞凋亡

目的研究布鲁杆菌S2株诱导BV-2小胶质细胞凋亡的机制,以发现神经型布鲁杆菌病药物治疗的新靶点。方法用布鲁杆菌S2株分别侵染BV-2小胶质细胞0、3、6、12、24 h,Western blot和RT-qPCR技术检测p-JNK、p53蛋白和mRNA表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞免疫荧光技术检测p-JNK蛋白核转运。结果布鲁杆菌S2株能促进BV-2小胶质细胞p-JNK、p53蛋白及mRNA表达,并增加p-JNK蛋白核转运。布鲁杆菌S2株能诱导BV-2小胶质细胞凋亡。结论布鲁杆菌S2株通过激活BV-2小胶质细胞JNK,促进p53表达,诱导细胞凋亡。

布鲁氏杆菌S2株DUF2326基因克隆与生物信息学分析

为了分析布鲁氏杆菌猪种S2疫苗株DUF2326基因编码蛋白的结构、功能以及抗原表位,试验对DUF2326基因进行克隆、生物信息学分析及抗原表位预测。结果表明:DUF2326基因全长1653 bp,编码550个氨基酸,分子质量为61.775 ku,理论等电点为5.34,呈酸性,不稳定指数为35.17,该蛋白无跨膜区,不存在信号肽,α-螺旋为二级结构的主要成分(59.64%)。DUF2326蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,含有较多潜在的B细胞抗原表位。说明DUF2326蛋白具有良好的抗原性,具备成为鉴别布鲁氏杆菌病疫苗免疫和自然感染抗原的潜力。

布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究

目的为了了解布鲁氏菌S2疫苗株全基因组结构及分子生物学功能。方法对布鲁氏菌疫苗株S2进行全基因组测序,并与GenBank公布的6株牛羊布鲁氏菌进行比较基因组学研究。结果与结论通过全基因组测序发现S2基因组大小为3 331 982bp,预测基因有3 243个,GC含量为57.23%。S2预测基因中大多数基因功能主要与糖代谢﹑氨基酸代谢﹑氨基酸转运和膜转运有关。通过比较基因组学研究发现S2有20个特有基因。另外S2与GenBank公布的S2序列进行比对发现有19个差异基因。

布鲁菌S_2株诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡及免疫激活的研究

目的:研究猪布鲁菌S2株诱导巨噬细胞(Mφ)的凋亡、活化及对T淋巴细胞的激活作用。方法:用猪布鲁菌S2株体外感染Mφ,并以大肠埃希菌作为对照,采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪测定感染后24小时Mφ的凋亡率;ELISA法检测感染后不同时间点Mφ培养上清中IL-12和TNF-α及感染后Mφ与T细胞共培养上清中IFN-γ的含量的变化。结果:瑞氏-姬姆萨染色显示布鲁菌S2株感染Mφ后1小时体积明显增大,突起增多,胞浆内可见大量布鲁菌;6小时细胞内细菌减少,但胞膜仍完整;至12小时细胞核固缩,胞膜失去完整性。流式细胞仪检测结果显示,感染后24小时Mφ的凋亡率均明显高于正常对照组及大肠埃希菌感染组(P<0.05)。ELISA结果显示S2株感染Mφ12、24、48小时的上清中IL-12和TNF-α含量均明显高于正常对照组(P<0.01),S2株感染后Mφ与T细胞共培养24、48、72小时产生的IFN-γ量高于正常对照组(P<0.05),但低于大肠埃希菌感染组(P<0.01)。结论:S2株可以引起Mφ的凋亡,同时可诱导Mφ活化,产生IL-12和TNF-α;布鲁菌感染后的Mφ可诱导T细胞活化,产生IFN-γ免疫应答。

密云地区羊布鲁氏菌病S2疫苗抗体消长规律分析研究

为掌握羊布鲁氏菌病疫苗免疫后的效果,掌握密云区羊布鲁氏菌病的整体动态和风险程度,从而为羊布鲁氏菌病强制免疫提供参考和理论支撑,达到密云区不发生羊布鲁氏菌病疫情、逐步退出免疫的目的,本研究对北京市密云区羊采用口服S2活疫苗后抗体的消长规律进行了研究。结果表明:羊在免疫后21~35d时血清抗体阳性率达到最高峰,与绵羊相比,山羊的抗体阳性率偏高;试管凝集试验、虎红平板凝集试验以及酶联免疫吸附试验检测的结果有较高的一致性。通过对研究中大量准确详实的实验数据分析,以期为掌握机体产生抗体的时间和规律、制定出适时科学的免疫程序达到尽快控制和净化疫病提供科学依据。

布鲁菌S_2株感染巨噬细胞与树突状细胞的比较

目的比较猪布鲁菌S2菌株感染巨噬细胞和树突状细胞(DC)的特点。方法采用瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态并计算吞噬率;用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-12和TNF-α以及与T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量;用annexin-Ⅴ-FITC/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果感染S2菌株1 h后巨噬细胞的吞噬率为(43.6±4.8)%,显著高于DC的吞噬率(13.08±2.36)%(P<0.05);正常巨噬细胞凋亡率为(3.09±1.21)%感染S2菌株后6、12和24 h的凋亡率分别为(19.89±1.36)%、(22.73±2.21)%和(42.44±3.12)%,明显高于DC感染后相同时间点的凋亡率(P<0.05),正常DC凋亡率为(1.82±0.01)%,DC感染S2菌株6、12、24 h凋亡率分别为(3.76±0.13)%、(7.87±0.56)%和(9.08±0.23)%。巨噬细胞在感染S2菌株后24、48 h分泌的IL-12均明显低于DC分泌IL-12的量(P<0.05);24、48、72 h分泌的TNF-α量均明显低于DC(P<0.01);在24、48、72 h与T细胞共培养分泌的IFN-γ含量均明显低于DC(P<0.01)。结论巨噬细胞吞噬猪布鲁菌S2菌株的能力高于DC,猪布鲁菌S2感染后巨噬细胞的凋亡率高于DC,感染S2菌株后DC的活化及提呈抗原并激活T细胞的能力强于巨噬细胞。

苎麻脱胶用菌株S2的酶液稳定性

对S2所产酶液的活性中心及其在不同环境、温度和pH值等条件下的稳定性进行分析。结果表明:不同金属离子对S2酶液活性的影响不同,Ca2+、Co2+对S2所产酶液具有显著促进作用,有利于酶液脱胶处理,而Cu2+、Zn2+等重金属离子对S2所产的酶液的活性具有比较强烈的抑制效应;酶活性在不同pH值、不同温度下的稳定性是不相同的,且不同条件下的稳定性差异很大,当pH值为8.5、最适温度为55℃时,S2酶活的稳定性比较高。

S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗对山羊免疫效果的比较试验

为了研究S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗对本地杂交山羊诱导的抗体消长动态规律、安全性及免疫效果,试验对36只不同日龄、不同性别的健康山羊(含妊娠母羊9只)随机平均分组,采用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)方法分别对口服S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗的试验山羊,在免疫后第7,14,21,42,90天时对血液中布鲁氏菌抗体进行检测。结果表明:两种疫苗一次免疫对本地杂交山羊的最长保护期为90 d,其中S2株布鲁氏菌减毒活疫苗可适用于不同日龄、不同性别本地杂交山羊使用,也适用于妊娠期间山羊的免疫;M5株布鲁氏菌减毒活疫苗可引起妊娠母羊免疫副反应及严重的流产症状。说明较M5株布鲁氏菌减毒活疫苗,S2株布鲁氏菌减毒活疫苗具有使用方便且安全有效的优势。

猪种布氏菌C_(73)强毒株与S_2菌苗株感染种猪的血清学鉴别诊断研究

广西是猪种布氏菌病流行的疫区。我们坚持以“检疫、免疫、淘汰病猪、推广人工授精”为主的综合措施防制猪布氏病，有效控制该病疫情。但在疫区应用猪型布氏菌二号弱毒菌苗免疫种猪，影响了猪布病的血清学诊断和对布病疫情的监测。为此，我们对猪种布氏菌强毒菌株Ｃ７３攻...

布鲁氏菌S2疫苗株实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的建立一种布鲁氏菌S2疫苗株的实时荧光定量PCR检测体系。方法依据布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌参考菌株全基因组序列的差异,设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测体系。自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,收集22株布鲁氏菌参考菌株及8种非布鲁氏菌对照菌株的DNA;同时自布病疫苗生产厂采集环境样本,使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取环境样本细菌DNA。对获取的DNA先行普通PCR预扩增,再以扩增的PCR产物为模板进行实时荧光定量PCR二次扩增(巢式荧光定量PCR),观察是否出现特异荧光曲线及相应的循环数(Ct值),并测试其灵敏性。结果建立的实时荧光定量PCR检测体系,除S2疫苗株外,其他21株布鲁氏菌参考菌株和8种非布鲁氏菌对照菌株均未检出特异荧光曲线(无Ct值)。建立的检测体系,检测布鲁氏菌S2疫苗株DNA的最低限为4.34 fg;采集的14份环境样本,其中3份检测到布鲁氏菌S2疫苗株DNA。结论建立的实时荧光定量PCR检测体系,能够检测到样本中布鲁氏菌S2疫苗株,具有较好的灵敏性和特异性。

负载布鲁杆菌WboA^(-/-)S_2株对小鼠骨髓源性肥大细胞的活化作用研究

研究猪种布鲁杆菌WboA-/-S2株对骨髓源性肥大细胞(BMMC)的激活作用。用粗糙型布鲁杆菌WboA-/-S2株感染BMMC,并以光滑型S2株作为对照,采用RT-PCR法观察BMMC载菌后不同时间点TLR4和TLR8表达的变化;用ELISA法检测感染后BMMC上清中TNF-α、IL-6、IL-1和IL-12的含量。结果显示负载WboA-/-S2株和S2株12h时BMMC TLR4的表达量均明显高于正常对照组,其中负载WboA-/-S2株的BMMC TLR4表达又明显高于S2株负载组,24h时二者表达均明显减弱;在负载12hWboA-/-S2株组BMMC TLR8表达明显高于正常对照组,而S2株组的BMMC TLR8与正常对照组相比条带无明显变化,24h时二者表达均减弱。负载WboA-/-S2株后3h、6h、12h、24hBMMC所分泌的TNF-α和IL-6都明显高于S2株负载组(P<0.05),而在负载两菌的BMMC上清中均未检测到IL-1和IL-12。结果表明WboA-/-S2株较S2株更易被BMMC识别,激活BMMC的能力也明显强于S2株,并可快速诱导BMMC分泌大量细胞因子。