西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。

运用MTT比色法检测印楝素对果蝇S2细胞的毒力作用

采用MTT(四甲基偶氮唑蓝,methylthiazolyl-tetrazolium)法测定不同质量浓度印楝素(0.01,0.1,0.5,1.0,2.0 mg.L-1)作用不同时间(24,48,72,96 h)对果蝇S2细胞的抑制率.结果表明,印楝素低质量浓度处理时,对果蝇S2细胞有促进生长的作用,表现为低质量浓度促进效应;在质量浓度为0.1～2 mg.L-1处理剂量范围内,表现为明显的时间依赖性,随时间延长,抑制率增加.0.5 mg.L-1处理48 h抑制率达54%,为最佳作用条件.

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定

目的:构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法:用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3-Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果:构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3-Control中增加了2.7万倍。结论:成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3-pac。

HCV结构蛋白E2在果蝇S2细胞中的稳定表达

目的获得在果蝇S2(S2)细胞中稳定表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(rE2)。方法 PCR扩增截短型E2基因,克隆至pCR2.1-T载体,将测序正确的基因亚克隆至表达载体pMT/Bip/V5-HisC,构建重组表达载体pMT-E2。用FuGENE HD转染试剂将pMT-E2转染至S2细胞,并筛选抗性细胞,然后诱导目的蛋白表达;以Western-blotting法鉴定表达产物与HCV感染者血清反应性。结果成功构建截短型HCV E2表达载体pMT-E2,并获得到稳定表达rE2蛋白的S2细胞株,Western-blotting法证明rE2具有良好的免疫学活性。结论在S2细胞成功表达的HCV rE2蛋白可用于HCV感染者血清的鉴定,为HCV诊断性抗原的优化和重组疫苗的研发提供了实验材料。

文冠果壳苷诱导人恶性黑色素瘤A375.S2细胞的凋亡及机制

目的观察文冠果壳苷对人恶性黑色素瘤A375.S2细胞增殖抑制作用及诱导凋亡的机理。方法采用四甲基噻唑蓝法(MTT法)检测化合物对细胞的生长抑制作用,光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态学变化,免疫印迹法(Western blotting)检测p-p38、p38、核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65及核转录抑制因子-κB(nuclear factor kappa B inhibitor,I-κB)蛋白表达水平,检测细胞核内NF-κB p65表达水平。结果文冠果壳苷可浓度依赖性地抑制A375.S2细胞增殖,并优于5-氟尿嘧啶(5-FU);10μmol·L-1文冠果壳苷作用于A375.S2细胞,形态学观察发现明显的凋亡小体和核固缩;Western blotting检测发现文冠果壳苷可时间依赖性地降低p-p38、p38、NF-κB p65及I-κB的蛋白表达水平;文冠果壳苷抑制NF-κB p65自细胞浆到细胞核的转位。结论文冠果壳苷可能通过抑制NF-κB和p38的活化诱导人恶性黑色素瘤A375.S2细胞凋亡。

英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞后的转录组分析

【目的】英诺克李斯特菌Listeria innocua为李斯特菌属Listeria的一种非致病菌,与致病菌单增李斯特菌L.monocytogenes具有共同的毒力祖先,本文旨在研究英诺克李斯特菌侵染后宿主基因表达的变化情况,为宿主调控、防御单增李斯特菌的危害提供参考。【方法】用英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞,利用转录组测序检测该细菌侵染后果蝇S2细胞的基因表达变化,采用qPCR验证英诺克李斯特菌侵染后果蝇S2细胞中差异表达的基因。【结果】英诺克李斯特侵染3 h后,宿主果蝇S2细胞中Toll/Imd信号通路发生显著上调,吞噬体和霍乱弧菌Vibrio cholerae感染信号通路显著下调;抗菌肽基因DmDef(DmDefensin)、DmDro(DmDrosomycin)、DmDpt A(DmDptericin A)、DmDpt B(DmDptericinB)、 DmMtk(DmMetchnikowin)、 DmCec A2(DmCecropinA2)、 DmAtt A(DmAttacinA)、 DmAtt B(DmAttacin B)、DmAtt D(DmAttacin D)、DmCec B(DmCecropin B)均被显著地诱导表达,其中,上调幅度最大的基因是DmDef,上调了9.805倍。qPCR验证结果显示,DmMtk、DmAtt A、DmDro和DmDef基因表达分别上调了8.180、7.533、7.204和4.569倍。【结论】英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞后,变化最显著的基因类群为抗菌肽。本研究全面调查了英诺克李斯特菌侵染后宿主基因表达的变化情况,为揭示非致病菌侵染后宿主细胞的反应、细菌与宿主的互作规律提供了参考。

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。

以果蝇表达载体系统构建可稳定表达抗菌性多肽Trappin-2的S2细胞株

目的采用果蝇S2表达系统,构建可与S2细胞基因组整合的分别含有Trappin-2和EGFP的重组质粒,筛选出两种抗性稳定可表达Trappin-2和EGFP的多克隆S2细胞株,为后期研究Trappin-2黏膜佐剂等生物学活性奠定基础。方法首先对pMT/Bip/V5-His A果蝇表达载体进行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信号肽,改造成为pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法从A549细胞中得到含信号肽的、完整的Trappin-2基因,在引物的5'端引入NotⅠ酶切位点及Kozak序列;引物的3'端引入XhoⅠ酶切位点和双终止密码子。利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pMT/V5-His A中,得到重组表达质粒pMT-Trappin-2(简称pMT-T2)真核表达载体。为了观察、比较转染效率和表达水平,同时构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EG-FP)的载体pMT/V5-His A-EGFP(简称pMT/EG-FP)。采用脂质体介导的转染技术将鉴定正确的两种质粒pMT-T2和pMT-EGFP分别与抗性筛选质粒pCoHygro(简称pro)共转入果蝇S2细胞中,用含有300 mg/ml潮霉素B的完全培养基进行筛选,经过3～4周,筛选出两种抗性稳定多克隆S2细胞株,用终浓度为500μmol/L的CuSO4诱导表达48 h后,分别通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2细胞中的表达水平。结果采用RT-PCR方法从A549细胞中得到Trappin-2基因,通过NotⅠ和XhoⅠ双酶切位点将Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A载体上,构建了pMT-T2和pMT-EGFP质粒,应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒pro共转染果蝇S2细胞,通过潮霉素B反复筛选,3～4周后,成功筛选到两种稳定的抗性多克隆细胞株,分别命名为S2-Trappin-2和S2-EGFP,用CuSO4分别诱导两个细胞株,在荧光显微镜下可观察到S2-EGFP主要表现为胞浆绿色荧光,RT-PCR结果证实Trappin-2在S2细胞中可稳定表达,Western blot分析S2-Trappin-2细胞培养上清可见分子量约10 ku的特异性条带,成功建立可稳定高表达Trappin-2和EGFP蛋白的果蝇S2细胞系。结论成功克隆了Trappin-2基因,并利用果蝇表达系统筛选到可分别稳定表达Trappin-2和EGFP的S2细胞株。S2-Trappin-2稳定表达细胞株的建立为进一步研究Trappin-2生物学特性、黏膜佐剂作用及在肺部感染等疾病中的应用奠定了基础。

剪接体蛋白SmD3在果蝇S2细胞中对U2A的影响

目的探讨小核糖核蛋白颗粒蛋白SmD3(small ribonucleoprotein particle protein SmD3,SmD3)表达改变对果蝇Schneider 2(S2)细胞中剪接体成分U2A的影响。方法通过转染构建敲减SmD3基因的S2细胞及其对照模型,并进行干涉效率验证。构建pUAS-attB-SmD3克隆,通过转染实现SmD3基因在S2细胞中的过表达。采用免疫荧光染色检测各组细胞模型中U2A蛋白的表达水平。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞模型中U2A mRNA的表达水平。结果选择干涉效率最优的SmD3 siRNA-1进行实验,与对照组比较,SmD3基因敲减组U2A蛋白及mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。成功构建pUAS-attB-SmD3克隆并在S2细胞中过表达,与对照组比较,SmD3基因过表达组U2A蛋白及mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P均=0.000)。结论SmD3基因编码的剪接体核心蛋白与U2A可能在果蝇S2细胞中发挥相互拮抗的作用。

人SNRPN基因在果蝇S2细胞中的功能研究

目的:构建人SNRPN(hSNRPN)基因过表达质粒,观察在果蝇S2细胞中的作用,为男性不育症的功能保守性研究提供重要工具。方法:构建pUAS-HA-hSNRPN质粒,利用Ub-GAL4质粒在果蝇S2细胞中驱动pUAS-HA-hSNRPN的表达。采用Western blot和免疫荧光染色观察HA-hSNRPN融合蛋白的表达情况。通过免疫荧光染色和qRT-PCR检测hSNRPN基因对果蝇RNA剪接体亚基表达水平的影响。结果:本实验成功构建了pUAS-HA-hSNRPN过表达质粒,并利用Ub-GAL4在果蝇S2细胞中驱动HA-hSNRPN融合蛋白的表达。Western blot检测和免疫荧光染色结果均显示HA-hSNRPN融合蛋白在果蝇S2细胞中成功表达。免疫荧光染色结果显示,在果蝇S2细胞中异位表达hSNRPN基因可下调U2A蛋白。qRT-PCR结果提示,异位表达hSNRPN基因可下调果蝇RNA剪接体关键因子的表达水平。结论:本研究成功实现了HA-hSNRPN融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达,hSNRPN可竞争性抑制果蝇RNA剪接体亚基的表达水平。

禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。

家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰

极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其插入带有V5和His标签的真核表达载体pMT/Bip/V5-His A中,成功构建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重组质粒,经转染果蝇S2细胞后,发现NbPTP1基因能在果蝇细胞中高效表达。此外,Lectin blotting和β-消除反应分析结果表明:果蝇S2细胞内表达的NbPTP1具有O-糖基化修饰特征。以上结果为研究NbPTP1的糖基化修饰特征与其功能之间的关系提供了基础,有助于揭示微孢子虫侵染机制,建立可行有效的微孢子虫病诊断和防治措施。

Cr(Ⅵ)对果蝇S2细胞凋亡影响及机制的初步研究

目的研究Cr（Ⅵ）对果蝇S2细胞凋亡的影响,初步探讨其可能的凋亡机制。方法将果蝇S2细胞分别暴露于含Cr（Ⅵ）终浓度为0（对照）、50、100、200、400、800μmol/L的新鲜培养基培养12 h。检测果蝇S2细胞的凋亡情况和凋亡相关基因Debcl、Buffy、Drice、P53 mRNA的表达水平及Drice的相对活化程度。结果 Cr（Ⅵ）处理浓度为400μmol/L时可观察到S2细胞染色质浓染、出现凋亡小体,当Cr（Ⅵ）浓度达到800μmol/L时,可明显观察到细胞崩解及坏死;与对照组比较,各剂量Cr（Ⅵ）染毒组果蝇S2细胞的早期凋亡率均较高,差异有统计学意义（P〈0.05）。当Cr（Ⅵ）浓度为50~400μmol/L时,果蝇S2细胞的早期凋亡率随着Cr（Ⅵ）浓度的上升而升高;当Cr（Ⅵ）浓度达到800μmol/L时,果蝇S2细胞的早期凋亡率下降。与对照组比较,400μmol/L Cr（Ⅵ）染毒组果蝇S2细胞Debcl、Drice mRNA的表达水平均较低,P53 mRNA的表达水平均较高,差异有统计学意义（P〈0.05）;而Buffy mRNA的表达水平无明显改变,Drice相对活化程度降低（P〈0.01）。结论天冬氨酸蛋白水解酶（Caspases）并未参与高浓度下Cr（Ⅵ）诱导果蝇S2细胞的凋亡过程,其凋亡机制可能与P53基因相关。

circHERC4通过调节miR-105-5p/Skp2轴抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探究circHERC4对结直肠癌(CRC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响与机制。方法 收集2020年6月~2021年12月在邵阳学院附属第一医院进行手术治疗的68例CRC病人的CRC组织和对应的癌旁组织。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织中circHERC4、miR-105-5p、细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2) mRNA表达水平;Western blot检测细胞中Skp2蛋白表达;CCK-8、平板细胞克隆实验、划痕愈合实验、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移、侵袭情况。结果 circHERC4、Skp2 mRNA在CRC组织中表达上调,而miR-105-5p表达下调(P<0.05),且CRC组织中circHERC4、miR-105-5p、Skp2 mRNA表达水平之间互呈相关性(P<0.05)。敲低circHERC4或过表达miR-105-5p可抑制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭及细胞中Skp2表达(P<0.05),而过表达Skp2可部分逆转miR-105-5p过表达对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P<0.05),且抑制miR-105-5p表达可部分逆转敲低circHERC4对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P<0.05)。结论 敲低circHERC4可通过调节miR-105-5p/Skp2轴抑制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭。

灭多威对果蝇胚胎S2和人肝癌HepG2细胞的遗传毒性研究

灭多威对环境中非靶标生物的毒性作用广受关注。选用果蝇胚胎S2细胞和人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)细胞活力测定、单细胞彗星电泳和磷酸化组蛋白(γH2AX)免疫荧光印迹等方法研究了灭多威的细胞毒性。结果表明:随着灭多威浓度的升高,S2和HepG2细胞活力均呈逐渐下降趋势;两种细胞均出现显著的彗星现象,且彗星尾长增加,尾部面积增大;γH2AX阳性细胞百分率逐渐增大。表明果蝇S2和人HepG2细胞DNA受损程度随着灭多威剂量的增大而加重,灭多威可诱导细胞DNA双链断裂,最终导致细胞凋亡。灭多威具有潜在的基因毒性,长时间接触会损害人类健康。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒在Sf9和S2细胞系中的感染性研究

【目的】调查研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9和果蝇S2胚胎细胞(Schneider’s Drosophila Line 2)中的感染性。【方法】以Sf9和S2作为CSBV体外感染的细胞系,通过RT-PCR检测CSBV的Vp1基因表达情况从而判断CSBV是否能在两种细胞中感染并增殖。【结果】在S2细胞中并未检测到CSBV,说明CSBV不能感染该细胞;接种了CSBV的Sf9细胞中并未表现出明显的致细胞病变效应(CPE),但在该细胞总RNA中可检测到Vp1基因的转录。通过克隆测序发现,从接种CSBV的Sf9细胞中克隆得到的Vp1基因序列与CSBV重庆分离株Vp1基因(NCBI登录号:KJ716806)同源性高达99%。系统进化分析显示,该序列与囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)中国分离株聚为一簇。但是,当感染CSBV的细胞传至第3代时检测不到CSBV。【结论】CSBV不能感染S2细胞而能感染Sf9细胞,且不能在后者中进行增殖,暗示后者可能含有某类可清除CSBV的因子,从而为寻找CSBV寄生增殖所必需的细胞因子提供了线索。

基于S2细胞建立钙库调控钙离子通道特异分子的筛选模型

应用FlexStation胞质溶胶钙离子检测技术,研究利用果蝇S2细胞建立钙库调控钙离子通道SOC的特异分子的筛选模型.通过三种已知钙通道拮抗剂的检测,发现培养温度为24℃,细胞密度为2×106个/mL时,利用终浓度为2μmol/L的SOC通道激动剂TG可建立稳定的细胞筛选模型.

宫颈癌HeLa细胞内SKP2结合蛋白的筛选和功能预测

目的:通过免疫共沉淀与质谱分析技术从宫颈癌HeLa细胞中获取与S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)结合的蛋白质群体并预测其生物功能。方法:以免疫共沉淀与Western blotting技术建立SKP2免疫共沉淀体系,以SDS-PAGE和银染技术获得SKP2结合蛋白的特异条带,通过质谱分析技术获得可能与SKP2结合的蛋白群体,应用生物信息学技术对筛选得到的蛋白进行GO分析与KEGG分析。结果:HeLa细胞内存在一定水平的SKP2蛋白表达,可进行免疫共沉淀反应;成功建立了SKP2免疫共沉淀体系,并获得SKP2结合蛋白样品;针对差异的凝胶条带进行质谱分析,共鉴定出SKP2结合蛋白563个;设定筛选条件后,获得可信度较高的SKP2蛋白270个,进行GO分析与KEGG分析后初步预测了结合蛋白参与的细胞功能和信号通路。结论:从宫颈癌HeLa细胞中成功筛选获取SKP2结合蛋白,为后续筛选靶标结合蛋白和寻找细胞靶向药物奠定了基础。

双载蛋白对果蝇S2细胞吞噬大肠杆菌的影响

该文研究了双载蛋白(amphiphysin,Amph)对果蝇S2细胞吞噬大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的影响。在S2细胞吞入E.coli后,Amph m RNA的表达水平明显升高;但用Amph-si RNA处理后的S2细胞,其Amph蛋白质水平显著低于正常和吞噬E.coli的S2细胞。透射电镜观察发现,S2细胞可以吞噬热灭活的E.coli,且细胞内存在典型的吞噬小体,而用Amph-si RNA处理的S2细胞内则未发现吞噬小体,说明Amph可能对吞噬体形成起关键作用。Amph-si RNA处理的S2细胞对E.coli的吞噬率显著低于未用Amph-si RNA处理的S2细胞,说明敲低Amph会显著地抑制S2细胞对E.coli的吞噬率。上述结果表明,Amph在果蝇S2细胞吞噬E.coli的过程中起重要的调节作用。