NH_(3)和H_(2)S降解功能菌的分离鉴定及降解特性研究

为了减少厨余垃圾堆放时恶臭气体的排放,本研究利用富集驯化、定性初筛和定量复筛法从厨余垃圾中分离筛选到2株对NH3和H2S均具有高效降解作用的菌株CN5和CS2。通过16S rDNA序列分析,分别鉴定为肠球菌属(Enterococcuss sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。通过单因素实验,确定两株菌的最佳除臭条件为:培养温度为35℃、pH为7、碳氮比25∶1、碳源为蔗糖、氮源为氯化铵,对NH_(3)和H_(2)S的降解率均能达到85%左右。菌株CN5和CS2在2∶3的混合状态下生长状况最好,p H值稳定,OD_(600)最大值为1.342。通过氨氮含量和硫酸盐含量测定实验发现,最终氨氮含量为50.5 mg/L,菌剂对氨氮降解率为85.3%;硫酸盐含量为302.7 mg/L,菌剂对硫酸盐生成率为89.2%。结果表明,从厨余垃圾中筛选得到的2株菌对NH_(3)和H_(2)S具有良好的降解能力,且两菌株相互之间具有协同作用。

布鲁菌S_2株诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡及免疫激活的研究

目的:研究猪布鲁菌S2株诱导巨噬细胞(Mφ)的凋亡、活化及对T淋巴细胞的激活作用。方法:用猪布鲁菌S2株体外感染Mφ,并以大肠埃希菌作为对照,采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪测定感染后24小时Mφ的凋亡率;ELISA法检测感染后不同时间点Mφ培养上清中IL-12和TNF-α及感染后Mφ与T细胞共培养上清中IFN-γ的含量的变化。结果:瑞氏-姬姆萨染色显示布鲁菌S2株感染Mφ后1小时体积明显增大,突起增多,胞浆内可见大量布鲁菌;6小时细胞内细菌减少,但胞膜仍完整;至12小时细胞核固缩,胞膜失去完整性。流式细胞仪检测结果显示,感染后24小时Mφ的凋亡率均明显高于正常对照组及大肠埃希菌感染组(P<0.05)。ELISA结果显示S2株感染Mφ12、24、48小时的上清中IL-12和TNF-α含量均明显高于正常对照组(P<0.01),S2株感染后Mφ与T细胞共培养24、48、72小时产生的IFN-γ量高于正常对照组(P<0.05),但低于大肠埃希菌感染组(P<0.01)。结论:S2株可以引起Mφ的凋亡,同时可诱导Mφ活化,产生IL-12和TNF-α;布鲁菌感染后的Mφ可诱导T细胞活化,产生IFN-γ免疫应答。

布鲁菌S_2株感染巨噬细胞与树突状细胞的比较

目的比较猪布鲁菌S2菌株感染巨噬细胞和树突状细胞(DC)的特点。方法采用瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态并计算吞噬率;用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-12和TNF-α以及与T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量;用annexin-Ⅴ-FITC/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果感染S2菌株1 h后巨噬细胞的吞噬率为(43.6±4.8)%,显著高于DC的吞噬率(13.08±2.36)%(P<0.05);正常巨噬细胞凋亡率为(3.09±1.21)%感染S2菌株后6、12和24 h的凋亡率分别为(19.89±1.36)%、(22.73±2.21)%和(42.44±3.12)%,明显高于DC感染后相同时间点的凋亡率(P<0.05),正常DC凋亡率为(1.82±0.01)%,DC感染S2菌株6、12、24 h凋亡率分别为(3.76±0.13)%、(7.87±0.56)%和(9.08±0.23)%。巨噬细胞在感染S2菌株后24、48 h分泌的IL-12均明显低于DC分泌IL-12的量(P<0.05);24、48、72 h分泌的TNF-α量均明显低于DC(P<0.01);在24、48、72 h与T细胞共培养分泌的IFN-γ含量均明显低于DC(P<0.01)。结论巨噬细胞吞噬猪布鲁菌S2菌株的能力高于DC,猪布鲁菌S2感染后巨噬细胞的凋亡率高于DC,感染S2菌株后DC的活化及提呈抗原并激活T细胞的能力强于巨噬细胞。

大黄鱼产H_2S菌生长动力学模型和货架期预测

以有氧冷藏大黄鱼为研究对象,建立了分别用于预测冷藏大黄鱼微生物学质量和剩余货架期的产H2S菌生长动力学模型和剩余货架期预测模型。产H2S菌在0℃、3℃、7℃、10℃的生长实验数据用于建立生长动力学模型表明,Gompertz方程能很好地描述产H2S菌在0～10℃温度区域的生长动态。最大菌数受贮藏温度的影响不大,在4种温度下平均值为(6.53±0.14)lgCFU/g。温度对最大比生长速率和延滞时间的影响,采用Belehradek方程描述均呈现良好的线性关系。又用5℃和8℃条件下贮藏大黄鱼来验证剩余货架期模型的准确性,得到货架期的预测值相比实测值的相对误差分别为-9.29%和-16.2%,显示建立的剩余货架期模型可以较快速实时地预测大黄鱼在0～10℃条件下有氧贮藏过程中的鲜度品质和剩余货架期。

肥大细胞对布鲁菌S_2株的模式识别及活化效应的体外研究

目的探讨体外培养的肥大细胞对猪布鲁菌S2株的模式识别及活化效应。方法骨髓来源的肥大细胞在体外感染猪布鲁菌S2株,瑞氏-姬姆萨染色法观察肥大细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色法观察肥大细胞脱颗粒情况;间接ELISA检测S2株感染后1 h和12 h肥大细胞释放组胺、IFN-γ、IL-12的含量;激光共聚焦显微镜检查肥大细胞对S2株的摄取状态;RT-PCR法观察S2株感染后12 h和24 h肥大细胞TLR4和TLR8基因的mRNA的表达;流式细胞术观察S2株感染后24 h肥大细胞TLR4和TLR8蛋白的表达。结果感染猪布鲁菌S2株的肥大细胞形态出现了明显的变化,S2株感染后1 h即出现明显的脱颗粒现象;S2株感染后1 h、12 h肥大细胞上清中组胺含量明显高于正常对照组(P<0.05),未检测到IFN-γ、IL-12;共聚焦显微镜检查发现感染30 min和1 h S2株主要黏附在肥大细胞表面,而未被肥大细胞摄入到细胞内;S2株感染12 h后肥大细胞TLR4mRNA的表达明显高于正常对照组,24 h时表达又减弱,和正常对照组相比,S2株感染24 h时肥大细胞TLR4蛋白的表达增加;S2株感染12 h和24 h后肥大细胞TLR8 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 S2株能黏附在肥大细胞的表面并能激活肥大细胞,引起其脱颗粒,释放组胺,但在实验观察的时间点内未见IFN-γ和IL-12的分泌,其机制可能是S2株通过TLR4被肥大细胞识别,但不能被肥大细胞摄取。

布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞体外模型的构建

目的构建布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞的体外模型。方法布鲁菌S2株采用大豆酪蛋白培养基培养4d,通过革兰染色及柯兹罗夫斯基染色进行细菌鉴定;布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞后,通过透射电镜和胞内菌落计数观察布鲁菌进入胞内的情况;通过细胞存活率和乳酸脱氢酶活性观察布鲁菌S2株对细胞膜的影响,外设空白对照组;采用流式细胞仪观察布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞凋亡的情况,外设空白对照组。结果透射电镜显示布鲁菌S2株能够感染脑微血管内皮细胞并存在于内吞泡内,胞内菌落计数法统计细胞内菌量发现,胞内活菌量随转染时间的延长而增加(P<0.05),感染48h胞内菌落数高于12h和24h(P<0.05),感染12h和24h胞内菌落数差异无统计学意义(P>0.05);台盼蓝染色结果显示空白组与处理组间细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);在感染初期(12h前)细胞内的乳酸脱氢酶活性会增高,会对细胞膜造成损伤,在24h到48h的时候,细胞内的乳酸脱氢酶活活性较低,对细胞膜的损伤较小;流式细胞仪检测显示空白组与处理组间细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验成功构建布鲁菌S2株感染脑微血管内皮细胞体外模型,明确了布鲁菌S2株能够进入脑微血管内皮细胞并在胞内存活。

苎麻脱胶用菌株S2的酶液稳定性

对S2所产酶液的活性中心及其在不同环境、温度和pH值等条件下的稳定性进行分析。结果表明:不同金属离子对S2酶液活性的影响不同,Ca2+、Co2+对S2所产酶液具有显著促进作用,有利于酶液脱胶处理,而Cu2+、Zn2+等重金属离子对S2所产的酶液的活性具有比较强烈的抑制效应;酶活性在不同pH值、不同温度下的稳定性是不相同的,且不同条件下的稳定性差异很大,当pH值为8.5、最适温度为55℃时,S2酶活的稳定性比较高。

普通生酮基古龙酸菌S_2基因文库的构建和筛选

在Vc生产的第2步发酵中,普通生酮基古龙酸菌S2能利用醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为Vc的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG).对普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA进行部分酶切,与黏粒载体pKC505连接后,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5α,构建成普通生酮基古龙酸菌S2基因组文库,得到12 000余个转化子.再利用纯化的醇醛脱氢酶免疫家兔制备出合格抗血清,应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)对文库进行筛选,获得1个阳性克隆K719#.通过检测此基因工程菌的活性,表明在添加辅酶PQQ后,K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中得到了表达,这为简化Vc的生产工艺奠定了基础.

邵阳市检出产H_2S肠致病性大肠埃希菌O_(128):K_(67)

在邵东牛马司矿区污染的生活饮用水和腹泻病人粪便中检出产H2S肠致病性大肠埃希菌(EPEC)O128:K67型,是引起牛马司矿区急性腹泻流行的主要病因,该菌为G-、生化反应、血清学鉴定、噬菌体裂解试验等符合埃希菌属的定义,药敏试验对多种抗生素耐药。致病性大肠埃希菌产H2S生化变异提示我们在注意生化反应典型的致病菌分离与鉴定时,应注意生化变异菌株的检查。

鸡粪中抑制产H2S细菌的分离纯化

为分离纯化鸡粪中抑制产H2S(硫化氢)细菌,通过细菌培养法测定鸡粪总活菌数,采用产H2S试验筛选产H2S菌和不产H2S菌。将两种菌株以不同比例混合到鸡粪中,通过产气量探究两种菌的相互作用。结果显示:从27株分离菌中筛选出19株不产H2S菌,8株产H2S菌;在新鲜鸡粪中混合添加两种菌,在不产H2S菌占优势的条件下可有效抑制产H2S菌产出H2S。结果为微生物性除臭剂的研发提供了优质菌,可有效减少鸡舍污染源。

新发现致病性产H_2S李斯特氏菌生物学特性研究

目的 对在畜间疫病流行区 ,新发现致病性产H2 S李斯特氏菌进行生物学特性研究 ,以确定其在微生物学中地位 ,为其命名提供依据。方法 从形态染色、培养特性、生化反应、抗原性方面鉴定 ,并利用分子生物学技术作DNAG +Cmol%含量测定 ,PCR、16SrRNA序列检测同源性。结果 通过表型生物学特性鉴定 ,产H2 S李斯特氏菌与已知 7型李斯特菌不同 ,其G +Cmol%为 3 0 .5 %、16SrRNA序列分析同源性与无害李斯特菌 (L .im)为 71.0 % ,灰色李斯特菌 (L .g)为 3 7.8% ,西氏李斯特菌 (L .s) 2 8.4 %。结论 经系统发育树分析 ,证实产H2 S李斯特氏菌为李斯特氏菌属 ,国际上首次报告的新种。

产H_2S致泻大肠埃希菌的发现与研究

〔目的〕对新发现的产H2 S致泻大肠埃希菌进行一系列实验研究 ,确认该菌在临床实践中的重要意义和流行病学价值。〔方法〕不同时间、不同标本中分离的不同血清型的产H2 S致泻大肠埃希菌 ,经形态学、培养特性、生化学、血清学等微生物学鉴定 ,初步判定后 ,报送国家权威实验室成都生物制品研究所鉴定并命名。〔结果〕在腹泻、食物中毒病人标本、水源水中分离的 5株产H2 S致泻大肠埃希菌 ,经全面鉴定后 ,其中 4株为EPECO12 8∶K67,1株为ETECO2 5∶K19。〔结论〕产H2 S致泻大肠埃希菌的发现使致泻大肠埃希菌家族增加了新的成员 ,为微生物学研究拓展了新的领域 ;该菌与大肠埃希菌有密切的亲缘关系 ,是变异的致泻大肠埃希菌 ;因其具有较强的致病性 ,故应引起有关部门的高度重视并采取相应的防治对策防止该菌造成新的腹泻病的传播和蔓延。

产H_2S肠道致病性大肠埃希菌O_(128):K_(67)的发现与研究

目的:对新发现的产H2S致病性大肠埃希菌进行一系列实验研究,确认该菌在临床实践中的重要意义和流行病学价值。方法:不同时间、不同标本中分离的产H2S致病性大肠埃希菌,经形态学、培养特性、生化反应、血清学反应等方法初步鉴定后,报送国家权威实验室成都生物制品研究所鉴定并命名。结果:在腹泻、食物中毒病人标本、水源水中分离的4株产H2S致病性大肠埃希菌,经全面鉴定后,均为EPECO128:k67。结论:产H2S致病性大肠埃希菌的发现使致病大肠埃希菌家族增加了新的成员,为微生物学研究拓展了新的领域;该菌与大肠埃希菌有密切的亲缘关系,是变异的致泻性大肠埃希菌;因其具有较强的致病性,故应引起有关部门的高度重视并采取相应的防治对策防止该菌造成新的腹泻病的传播和蔓延。

布鲁菌S2株感染巨噬细胞后对小胶质细胞极化的影响

目的确定布鲁菌S2株感染巨噬细胞后对BV-2小胶质细胞极化的影响。方法用布鲁菌S2株感染RAW264.7巨噬细胞24及48h后,收集未感染巨噬细胞的上清液(COU)和感染巨噬细胞24h的上清液(COB24h)及48h的上清液(COB48h),BV-2细胞经上述上清液分别处理24h。实验分为空白对照组、COU组、COB24h组、COB48h组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态。RT-qPCR检测iNOS、TNF-α、Arg-1mRNA的表达。ELISA检测培养细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)的水平。免疫组化染色法观察iNOS蛋白的表达。结果 BV-2细胞经上清处理后,镜下观察COB24h、COB48h处理的BV-2细胞胞体变大,细胞核变大,突起较多,并较空白组伸长明显,呈长杆状。与空白对照组比较,COB24h组与COB48h组BV-2细胞iNOS及TNF-αmRNA的表达升高(P均<0.01),Arg-1 mRNA的水平降低(P<0.01),且COB48h组iNOS mRNA表达升高(P<0.01);COB24h组与COB48h组上清中TNF-α、IL-1β的含量升高(P均<0.01),COB48h处理组IL-10的含量降低(P<0.05)。免疫组化染色法观察BV-2细胞中iNOS蛋白阳性表达在胞浆中,为橙色颗粒,COB48h组胞浆中iNOS蛋白的表达高于空白对照组。结论布鲁菌S2株感染巨噬细胞后的上清液可以驱动小胶质细胞向经典激活的巨噬细胞(M1)极化。

猪腹泻大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

采集腹泻猪直肠拭子分离鉴定大肠埃希菌,采用微量稀释法测定分离菌对卡那霉素、氟苯尼考、氨苄西林、乳酸环丙沙星、头孢曲松钠、硫酸庆大霉素、磺胺嘧啶钠、强力霉素8种药物的敏感性,为兽医临床用药提供依据。结果表明,共分离并鉴定出33株猪腹泻大肠埃希菌,其中29株经鉴定为产H2S大肠埃希菌,33株菌对卡那霉素、氟苯尼考、氨苄西林、乳酸环丙沙星、头孢曲松钠、硫酸庆大霉素、磺胺嘧啶钠、强力霉素的MIC50分别为>256、256、>256、16、>0.125、>256、>512、32μg/mL,耐药率依次为100%、97%、100%、88%、21%、85%、100%、85%。33株菌均为多重耐药菌株,最少可耐4种药物,最多可耐8种药物,其中耐8种药物的菌株占6.1%(2/33),耐7种药物的菌株占69.7%(23/33),耐6种药物的菌株占18.2%(6/33),耐5种药物的菌株占3.0%(1/33),耐4种药物的菌株占3.0%(1/33)。33株猪腹泻大肠埃希菌对8种常用抗菌药物的耐药谱广,耐药率高,兽医临床应根据试验结果调整用药方案。

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。