杉虎杂交斑5S rRNA基因甲基化分析

核糖体RNA是构成核糖体的重要组成部分,在蛋白质合成过程中起着重要作用。利用雌性棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)与雄性清水石斑鱼(Epinephelus polyphekadion)杂交,获得在生长、肉质等方面具有一定优势的子代——杉虎杂交斑。对杉虎杂交斑及其亲本5S rRNA基因编码区前1 000 bp、编码区以及非转录区的DNA甲基化水平进行测定和比较分析。结果表明,杉虎杂交斑5S rRNA基因整体甲基化水平(0.418)高于棕点石斑鱼(0.379)和清水石斑鱼(0.037),但与母本棕点石斑鱼不具有显著性差异,与父本清水石斑鱼存在显著性差异。对5S rRNA基因编码区和非转录区的甲基化位点进行分析发现,在棕点石斑鱼与杉虎杂交斑中所有甲基化位点是一致的,但在清水石斑鱼中均未发现这些位点,表明杉虎杂交斑的5S rRNA基因甲基化模式与母本棕点石斑鱼一致。结果阐明了杉虎杂交斑5S rRNA基因的DNA甲基化水平和模式,为石斑鱼杂交育种提供理论基础。

利用CEL Ⅰ酶鉴定水稻广亲和基因S5位点的籼粳属性

广亲和基因S5的克隆为水稻品种亲和特性的鉴定提供了分子学依据。利用PCR技术对水稻S5位点中籼、粳序列间存在差异的区段进行扩增,并结合芹菜核酸内切酶CELⅠ对其进行酶切鉴定,从而区分S5不同的基因型。研究结果表明该方法能准确鉴定不同水稻品种中S5位点的籼粳特性,并能发现新的差异序列。

水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用

广亲和基因S5-n是能够恢复籼、粳杂种育性的基因,利用常规育种方法回交转育广亲和基因需要通过配组杂种F1,根据F1的育性判断和选择S5-n,选育周期长,方法繁琐。因此,在广亲和遗传改良和聚合育种中需要寻找一种快速、简便的广亲和基因检测方法。本研究根据水稻广亲和基因和籼粳S-5等位基因序列存在136bp缺失的特征,设计了InDel标记S5136。前人研究已经明确02428、Dualr、CPSLO17具有S5-n,分子标记S5136 PCR扩增这3个材料的带型为缺失带型,而不携带广亲和基因S5-n的材料的带型为非缺失带型。利用该标记对3037与02428的F2群体分析表明,该标记能准确区分S5-n、S5-i纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记从554份水稻品种资源(O.sativa L.)和27份普通野生稻(O.rufipogen Griff.)以及24份江淮流域杂草稻资源中筛选出具有缺失带型的资源材料13份,并对其PCR产物测序证实为S5-n,对Kasalath的广亲和性进行了初步验证;从20份02428的高世代育种材料中,筛选到携带广亲和基因S5-n的恢复系2份。该标记可以用于S5-n基因资源筛选、分子标记辅助选择育种和培矮64S为母本的杂交种种子纯度鉴定。

水稻微核心种质中广亲和基因S5^n的筛选

利用S5n的功能标记扩增197份栽培稻微核心种质,从中筛选携带广亲和基因S5n的材料,并检验亲和性。结果表明,共筛选到11份(湖恢628、本邦谷、毫补卡、小红谷、饭毫皮、飞蛾糯2、特青选恢、包协-7B、毫马克(K)、清可、老造谷)含有S5n特异带型的水稻种质,将其与籼稻9311和粳稻日本晴杂交,其F1结实率均高于75%,表现广亲和性。这批广亲和性材料可为籼粳亚种间的优势利用及品种选育提供更多的可利用资源。

利用广亲和基因S5-n的功能标记鉴定水稻资源和检测杂交种纯度

为开发利用水稻广亲和基因S5-n的功能标记筛选了部分资源以及鉴定了以培矮64S不育系为母本的杂交种种子纯度。应用广亲和基因S5-n的功能标记S5136从不育系中筛选出携带广亲和基因S5-n的不育系粤泰A,并利用测序证实,同时发现在缺失下游有1个单碱基的突变,与来源于印度的广亲和材料相同;对以培矮64S为母本的杂交稻两优986的种子中不育系自交结实情况进行了判定,从233棵苗中发现4株培矮64S,自交结实率为1.72%。同时比较了SDS方法和简易DNA快速提取方法的PCR结果,发现利用简易方法提取的DNA当天扩增也可以获得较好的PCR结果,但常温保存2周后,以简易方法提取的DNA为模板难以获得PCR产物。因此,S5-n基因的功能标记S5136可以用于广亲和基因的资源鉴定以及鉴定以培矮64S为母本的杂交种自交结实率。

基于四引物扩增受阻突变体系PCR快速鉴定水稻S5基因的籼粳属性

四引物扩增受阻突变体系PCR是一种快速简便检测SNP的方法。基于该技术原理,结合籼型S5^i与粳型S5^j基因存在的单核苷酸差异设计特异性引物,并用8个籼稻1、8个粳稻及4个籼粳杂交后代F_1,进行PCR扩增检测验证。依据产物的电泳谱带类型能准确区分出S5^i纯合基因型、S5^j纯合基因型及杂合基因型3种类型,其扩增带型与基因型完全吻合。这表明所设计引物能很好地对S5基因的籼粳属性进行区分,可广泛应用于水稻种质资源相应目的基因的鉴定,为籼粳杂种优势利用的亲本有效选择和籼粳分化研究提供重要参考。

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表达

【目的】探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)安徽分离物(SRBSDVAn Hui-HN2)的遗传特性,并获得原核表达的P5-2蛋白。【方法】RT-PCR扩增SRBSDV S5片段,克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插入原核表达载体,重组载体转化大肠埃希菌并用IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表达情况。【结果】SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段全长3 167 bp,包含S5-2基因全长612 bp,编码204个氨基酸。序列比对结果显示,SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段与其他SRBSDV分离物S5片段的序列相似性极高,达99.0%~99.7%,而与斐济病毒属(Fijivirus)其他成员S5片段的序列相似性较低,仅为38.0%~71.3%;构建的S5片段系统发育树表明SRBSDV和RBSDV聚成1个分支,其中6个SRBSDV分离物聚成1个亚分支。原核表达获得相对分子质量约为47 000的重组蛋白,Western blot分析显示,GST单抗能够与重组融合蛋白发生特异性反应。【结论】SRBSDV各分离物之间亲缘关系非常近,而与Fijivirus其他成员亲缘关系较远,原核表达获得的融合蛋白为靶标蛋白。

D5S818基因座等位基因丢失对亲子鉴定结果的影响

目的 分析PowerPlex21检测体系中D5S818基因座的等位基因丢失现象,探讨其对亲子鉴定结果的影响。方法 利用Chelex-100法提取样本的DNA。用PowerPlex21体系对3 248例家系研究对象进行20个常染色体STR基因座的复合扩增,分析毛细管电泳后STR基因座的等位基因分型。对发现的D5S818基因座可能存在的等位基因丢失情况,采用Identifiler体系扩增进行验证。结果 经过Identifiler检测体系验证,在5个家系中发现7名个体利用PowerPlex21体系检测存在D5S818基因座等位基因12的丢失情况。结论 等位基因丢失易被误判为发生了基因座的“突变”,对亲子鉴定的累积亲权指数结果有一定的影响。可采用具有相同STR基因座的不同检测体系验证解决,以保证得出正确的亲子鉴定结论。

汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义，为核蛋 白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物，用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ 基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ），用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中，成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体，并通过脂质体转 染至Ｖｅｒｏ细胞中，进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率，目 的基因能在宿主细胞中表达，有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。

转FGF5s基因的陕北白绒山羊粪便菌群分析

为了对转FGF5s基因陕北白绒山羊的生物安全进行评价,试验以转FGF5s基因和野生型陕北白绒山羊为研究对象,采集其新鲜粪便样品,用灭菌生理盐水进行梯度稀释后分别接种LB固体培养基、胆硫乳琼脂培养基、肠球菌琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基和甘露醇盐琼脂培养基,37℃恒温过夜培养后分别对培养基上生长的所有需氧菌、沙门氏杆菌、肠球菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌进行菌落计数,并进行差异显著性检验。结果表明：微生物在5种培养基上形成不同的菌落形态,菌落计数之后对数据进行统计分析,结果差异不显著（P〉0.05）。说明转FGF5s基因与野生型陕北白绒山羊粪便中的需氧菌菌群结构间不存在显著差异。

利用广亲和基因S5-n的功能标记鉴定特殊配组类型杂交种纯度研究

“粳不育系/广亲和恢复系”配组方式在浙江省得到了越来越多的应用。广亲和基因S5-n的功能标记可快速检测种子纯度。为验证水稻广亲和基因S5-n功能标记鉴定粳不育系/广亲和恢复系配组方式杂种一代的效果,我们分别将长粳1A和6个恢复系获得的F 1代进行大田统计和分子标记鉴定,结果显示,由于广亲和基因S5-n分子标记不能特异性检测出串粉形成的异形株,导致其鉴定结果较大田统计鉴定结果高1.0~2.0百分点。未来还需要进一步优化广亲和基因分子标记技术的特异性,进而提高分子检测的准确性,这将有助于杂交稻的安全生产。

CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除的小鼠模型,为研究鞘氨醇-1-磷酸受体5(sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5)在异基因造血干细胞移植中的作用提供实验工具。方法:根据S1PR5基因第三外显子碱基序列,设计针对S1PR5基因的sgRNA(single guide RNA),构建sgRNA表达质粒,利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6小鼠的受精卵进行显微注射。使用T7E1酶切和或基因测序检测S1PR5基因碱基的突变情况,然后应用q PCR和Western blot方法检检测S1PR5是否被成功敲除。结果:获得了2种S1PR5基因突变的F2代纯合子小鼠,即基因分别缺失170 bp和215 bp的S1PR5-170/-170小鼠和S1PR5-215/-215小鼠。在这两种小鼠中,S1PR5在mRNA和蛋白水平均没有表达。结论:成功建立了S1PR5基因敲除的小鼠模型,为探讨S1PR5在异基因造血干细胞移植的作用提供了研究平台。

膀胱癌D17S5位点VNTR多态性研究

膀胱癌Ｄ１７Ｓ５位点ＶＮＴＲ多态性研究王德育袁春伟（东南大学国家教委分子与生物分子电子学实验室，南京２１００９６）可变数目串联重复序列（ＶａｒｉａｂｌｅＮｕｍｂｅｒＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔｕｎｉｔｓ，ＶＮＴＲｓ）是广泛存在于人类基因组中的ＤＮＡ片段...

白纹伊蚊感染登革2型病毒后基因表达变化的研究

白纹伊蚊感染登革 2型病毒 2 4h后 ,和对照蚊虫一起提取RNA ,用差异显示PCR (DDRT PCR)技术对蚊虫感染病毒后基因表达的变化进行研究。白纹伊蚊感染登革 2型病毒后 ,经过 8条随机引物和 3条 3′端锚定引物配对扩增 ,发现了 6条表达有差异的片段 ,其中 5条为感染后表达量增加的片段 ,1条为感染后表达量减少的片段 ,并对这些片段进行了克隆和测序 ,通过GenBank查询 ,其中 5条为未知序列 ,1条表达量增高的片段和果蝇核糖体蛋白S5基因有较高的同源性。

水稻不育系的广亲和基因检测及籼粳型分析

为鉴定部分水稻不育系的广亲和性和籼粳型,根据籼粳亚种间广亲和基因S5-n在第6染色体存在136 bp片段缺失的特征,设计InDel标记S5136,对培矮64S、广占63S等不育系进行广亲和基因鉴定。利用与栽培稻籼、粳遗传分化密切相关的34个InDel标记,对这些不育系PCR产物的电泳结果进行判读和分析,计算其籼型或粳型基因频率(InDel分子指数法)。结果表明:①三系不育系粤泰A具有广亲和基因S5-n。②两系不育系培矮64S、N111S、C815S等11个不育系具有广亲和基因S5-n。③目前广泛应用于生产的不育系培矮64S、广占63S、Y58S等的籼型基因频率均为0.76～0.91,据此认为具有10%～25%左右粳稻血缘的籼型不育系可能更有利于亚种间杂种优势利用。

D5S818基因座稀有等位基因5的确认

1案例资料1.1案情概述本鉴定所日常检案中的一起亲子鉴定案,鉴定案件两样本均为滤纸血斑(下文代称:被检父、孩子)。1.2初次检验采用chelex-100法提取血斑样品DNA,使用MicroreaderTM21 ID System身份鉴定试剂(苏州阅微基因技术有限公司)在K960型PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)上扩增。

基于功能性标记和测序发掘携带有S5^n基因的水稻新种质

水稻籼粳亚种间杂种具有强大的生物学优势,但杂种F1普遍高度不育,难以直接利用.S5n基因可以克服由S5基因座位互作引起的杂种不育性.目前S5n基因已被成功克隆,该基因功能区存在大片段的缺失DNA,为快速并准确发掘携带有S5n的水稻新种质提供基础.本文将S5n基因序列与日本晴相对应序列进行比对,在S5n基因缺失DNA的两端设计引物,对已知携带有S5n和不携带有S5n基因(但携带有S5i或S5j)的水稻材料进行PCR扩增检测,建立S5n基因的功能性标记.利用该标记对我国水稻微核心种质进行检测,其中有10个品种的S5座位中存在DNA片段缺失,这些品种可能携带有S5n基因.这些品种包括毫补卡、小红谷、老造谷、三磅七十箩、木邦谷、魔王谷内杂、饭毫皮、飞蛾糯2、包协-7B和特青选恢等,其中除三磅七十箩和老造谷外,其余的8个品种均未见报道携带有S5n基因.对存在缺失DNA的10个品种的扩增片段进行测序,发现全部品种S5座位的缺失DNA片段都与02428和零轮(已知携带有S5n)的一致,说明这10个品种S5座位的基因也是没有功能的,证明确实存在S5n基因.

导致D5S818等位基因丢失的突变确认1例

1案例资料1.1简要案情在日常一例二联体父女鉴定的检案中,我们采用Power Plex?21试剂盒(Promega公司,美国)进行亲子鉴定过程中,发现D5S818基因座存在等位基因丢失情况。1.2实验方法采用常规Chelex-100法提取争议父和孩子的基因组DNA;分别使用Power Plex?21试剂盒、Golden EyeTM20A试剂盒(北京基点认知技术有限公司)和AGCU Expressmarker 22试剂盒(无锡中德美联公司)进行STR复合扩增;扩增产物通过3130型遗传分析仪(Applied Biosystems公司,美国)进行毛细管电泳,Gene Mapper ID v3.2.1软件分析各基因座的基因型。

中国科学家在水稻籼粳杂种不育研究取得突破性进展

2008年,华中农业大学张启发院士以及华南农业大学刘耀光教授领导的研究团队先后在《美国科学院院报》发表了他们对籼粳稻杂种不育的最新研究成果。其研究团队不仅分别克隆了控制水稻杂种雌配子(胚囊)育性基因座位上的广亲和基因S5和雄配子不育基因Sa,还对这些基因所在座位等位基因之间的相互作用关系进行了详细分析,提出了S5基因座上三等位基因系统(triallelic system)模式和Sa座位中的"两基因/三元件互作"的模型(two-gene/three-component interaction model)。他们的研究成果在水稻杂交育种和水稻品质改良方面均有重要的应用价值,在生物进化中生殖隔离形成的分子机理上提供了具有重要理论价值的证据。这是中国科学家继2006年阐明BoroⅡ型水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理以后,在植物杂种不育机理研究方面又一次做出的重要贡献。

水稻不育系的广亲和基因检测及籼粳型分析

根据水稻广亲和基因S5-n存在136 bp缺失的特征,设计InDel标记S5136对培矮64S、广占63S等不育系进行广亲和基因鉴定。利用与栽培稻籼、粳遗传分化密切相关的34个InDel位点,对这些不育系PCR产物的电泳结果进行判读和分析,计算其籼型或粳型基因频率(InDel分子指数法)。结果表明:粤泰A具有广亲和基因S5-n,且与来源于印度的籼稻Kasalath等存在1个相同的单碱基突变;培矮64S、N111S、C815S等10个不育系具有广亲和基因S5-n;目前广泛应用于生产的不育系培矮64S、广占63S、Y58S等的籼型基因频率均在0.76～0.91。