培养细胞SAA3启动子调控基因表达及对炎症信号的响应特性研究

目的：利用构建的血清淀粉样蛋白启动子（SAA3）报告基因表达载体观察SAA3启动子／增强子应用于调控目的基因在培养细胞株的表达及对炎症刺激的响应特性，探索SAA3用于调控靶基因的可能性。方法：pSAA3CAT3采用脂质体转染U937细胞、肝细胞株SMMC7721，48h后LPS、重组rIL－6＋rIL-1、巨噬细胞活化上清（CM）攻击、测定不同时间CAT的诱导表达（ELISA法）。结果：LPS活化的转染U937细胞，6hCAT开始表达，24h达峰值，LPS活化后4．6倍增加CAT基因的表达，72h开始下降；重组rIL－6＋rIL－1联合诱导，10％、20％CM诱导转染SMMC7721细胞24h可启动报告基因表达，20％的条件活化上清诱导作用显著，6h始启动，36～48h达峰值，96h下降；本研究结果显示在0．1～62．5ng／ml的剂量范围内，rIL－6＋rIL－1联合诱导剂量依赖诱导转染U937细胞、SMMC7721细胞报告基因CAT的表达。结论：本研究证实SAA3启动子转录调控序列（－306～＋47）可启动SMMC7721、U937细胞转染报告基因CAT表达．SAA3启动子适用于构建炎症诱导性表达载体，将为基因治疗的表达调控提供新治疗策略及方法。

腺病毒介导IκBα基因在体外培养U_(937)细胞中的表达及效应研究

目的 通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体 ,并用急性相反应蛋白SAA3 启动子来指导目的基因IκBα的表达 ,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF κB活性的调控作用 ,对炎症介质产生的抑制效应。方法 采用DNA重组与同源重组技术 ,构建含只响应病理信号的启动子 急性相反应蛋白启动子SAA3 、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体 (AdIκBα)。应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞 ,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U93 7中诱导性表达IκBα(Westernblot)、对NF κB活性的调控 (EMSA)及体外效应。结果 ①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒 (pAdpLplSAA3 NLSIκBα) ,该表达框含SAA3 启动子 ,SV40 大T抗原核定位信号 (NLS) ,IκBαcDNA和ployA ;②pAdpLpLSAA3 NLSIκBα质粒与pJM1 7同源重组 ,脂质体 (DOTAP)介导 ,共转染入 2 93细胞。PCR法筛选阳性克隆 ,获得重组腺病毒 (AdIκBα) ;③用 2 93细胞扩增AdIκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒 ,获得高滴度 (5× 1 0 1 0 pfu/ml)重组腺病毒 ;④体外实验 ,用 50MOIAdIκBα预感染体外培养的U93 7细胞 ,再用LPS攻击后 ,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白 (Westernblot) ,且表达的IκBα能抑制NF κB的活化 (EMSA)

炎症诱导性表达载体的构建及白介素-10基因转染对烫伤内毒素血症小鼠保护作用的实验研究

炎症诱导性表达载体的构建及白介素┐１０基因转染对烫伤内毒素血症小鼠保护作用的实验研究ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅｅｘｐｒｅｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａｌＩＬ┐１...

白细胞介素-10基因转染对活化巨噬细胞炎症介质产生的抑制作用

目的 探讨炎症诱导启动子指导人白细胞介素 10 (hIL 10 )基因的表达及其对炎症介质产生的效应。方法 诱导性真核表达载体pSAA3hIL 10脂质体转染体外培养巨噬细胞 ,LPS(10mg/L)活化后观察巨噬细胞hIL 10的表达 (RT PCR ,ELISA法 ) ,测定肿瘤坏死因子 α(TNF α)、IL 6的产生(ELISA法 )。结果 RT PCR证明hIL 10可在巨噬细胞表达 ;巨噬细胞LPS(10mg/L)活化 12h有hIL 10的表达(2 .67μg/L) ,活化 2 4h及 4 8h的巨噬细胞上清hIL 10显著增加(1.87～5 .71倍 ) ;转基因预处理显著下调活化细胞TNF α(2 5 .0 %～ 61.4 % ,P <0 .0 5 )的产生 ,显著减少IL 6产生 (5 4 .8%～63 .9% ,P <0 .0 5 )。结论 LPS可活化 pSAA3hIL 10表达体系在巨噬细胞诱导表达 ,白细胞介素 10基因转染显著下调活化MΦ炎症介质的产生。