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弓形虫表面主要抗原1(SAG1)蛋白的原核表达与鉴定
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作者 代琴 骆璐 +5 位作者 董春霞 凌洪权 吴胜昔 曾政 秦萍 韦广苗 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第12期69-73,128,共6页
为了实现弓形虫主要表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)蛋白在原核表达系统中的高效表达,试验根据GenBank中弓形虫SAG1基因序列(登录号为S76248.1)及大肠杆菌密码子偏好性对目的基因序列进行优化设计,以pET-32a(+)为表达载体构建重组表... 为了实现弓形虫主要表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)蛋白在原核表达系统中的高效表达,试验根据GenBank中弓形虫SAG1基因序列(登录号为S76248.1)及大肠杆菌密码子偏好性对目的基因序列进行优化设计,以pET-32a(+)为表达载体构建重组表达质粒pET32a(+)-SAG1,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对重组菌进行诱导,表达重组蛋白,通过优化诱导条件实现对重组蛋白的大量表达,使用NGC^(TM)层析纯化系统纯化重组蛋白,并分别以抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清作为一抗、羊抗鼠IgG-HRP和HRP-兔抗犬作为二抗对重组蛋白进行Western-blot鉴定。结果表明:重组表达质粒pET32a(+)-SAG1经双酶切分别在5 900 bp和1 020 bp处出现1条载体条带和1条目的基因条带,与预期结果相符;重组蛋白大小为55 ku且以包涵体的形式成功表达,当诱导条件为25℃、0.4 mmol/L IPTG诱导8 h时重组蛋白的表达量最高;纯化后的重组蛋白条带单一,纯度较高,3个样品质量浓度分别为0.409 5,0.368 5,0.451 9 mg/mL;表达的重组蛋白与抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清均能特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了弓形虫SAG1重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度和质量浓度较高,且具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 原核表达 镍柱纯化 蛋白免疫印迹
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刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性的比较研究
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作者 叶建军 田静 +4 位作者 高传亮 闫安 叶利颖 王宇冰 宋淇淇 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第21期18-25,共8页
为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen,SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果,试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-SRS2... 为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen,SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果,试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定,同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染,再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况;用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠,用ELISA法测定血清IgG水平,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比,ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况;进行小鼠体内攻虫试验,记录小鼠存活时间。结果表明:成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku;pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4^(+)/CD8^(+)值均显著提高(P<0.05);pEGFP-SRS29C组和联合免疫组γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显提高;联合免疫组诱免疫球蛋白G(IgG)、IFN-γ和TNF-α含量均高于pEGFP-SRS29C组和pEGFP-SAG1组。PBS组和空载体组小鼠存活8~9 d;pEGFP-SRS29C组小鼠存活(18.10±1.37)d,pEGFP-SAG1组小鼠存活(21.20±0.97)d,联合免疫组小鼠存活(24.20±1.72)d,极显著长于PBS组和空载体组(P<0.01)。说明单独使用构建的弓形虫核酸疫苗pEGFP-SRS29C或与pEGFP-SAG1联合使用能够诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力,并且SRS29C作为保护性抗原与SAG1联合免疫的效果更好。 展开更多
关键词 弓形虫 核酸疫苗 SRS29C sag1 重组质粒 联合免疫
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弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量:15
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作者 杨婷婷 何深一 +5 位作者 张加勤 周怀瑜 丛华 古钦民 李瑛 赵群力 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第5期410-413,共4页
目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ... 目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP2 复合基因 DNA疫苗 流式细胞术
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弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护性 被引量:10
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作者 孙怡 何深一 +5 位作者 丛华 杨婷婷 周怀瑜 古钦民 李瑛 赵群力 《国际医学寄生虫病杂志》 CAS 2006年第1期2-5,共4页
目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒。ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ... 目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒。ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定免疫鼠脾脏NK细胞杀伤率;流式细胞仪测定T细胞亚群;用弓形虫速殖子腹腔攻击感染小鼠,观察小鼠的生存时间。结果SAG1-SAG2组小鼠IgG抗体、IFN-γ、IL-2及CD4+/CD8+细胞比例均高于SAG1组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合DNA疫苗组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗较SAG1单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sagl sag2 复合基因 DNA疫苗
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弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量:4
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作者 李首庆 古钦民 +1 位作者 杨广民 马寅芙 《中国实验诊断学》 2008年第10期1219-1222,共4页
目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后... 目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后加强免疫一次。另设立pcDNA3.1及PBS对照组。于3次免疫后4周作免疫指标测定(包括ELISA法测定小鼠血清IgG抗体及细胞因子IFN-γ、IL-4,MTT法测定小鼠淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性),并观察弓形虫速殖子攻击感染后小鼠的生存时间。结果SAG1-GRA2组小鼠血清IgG抗体、IFN-γ、淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性均高于SAG1及GRA2组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合基因组小鼠生存时间较单基因疫苗组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-GRA2复合基因疫苗较SAG1、GRA2单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 GRA2 复合基因 疫苗
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Geophysical prediction of organic matter abundance in source rocks based on geochemical analysis:A case study of southwestern Bozhong Sag,Bohai Sea,China 被引量:1
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作者 Xiang Wang Guang-Di Liu +5 位作者 Xiao-Lin Wang Jin-Feng Ma Zhen-Liang Wang Fei-Long Wang Ze-Zhang Song Chang-Yu Fan 《Petroleum Science》 SCIE EI CAS CSCD 2024年第1期31-53,共23页
The Bozhong Sag is the largest petroliferous sag in the Bohai Bay Basin,and the source rocks of Paleogene Dongying and Shahejie Formations were buried deeply.Most of the drillings were located at the structural high,a... The Bozhong Sag is the largest petroliferous sag in the Bohai Bay Basin,and the source rocks of Paleogene Dongying and Shahejie Formations were buried deeply.Most of the drillings were located at the structural high,and there were few wells that met good quality source rocks,so it is difficult to evaluate the source rocks in the study area precisely by geochemical analysis only.Based on the Rock-Eval pyrolysis,total organic carbon(TOC)testing,the organic matter(OM)abundance of Paleogene source rocks in the southwestern Bozhong Sag were evaluated,including the lower of second member of Dongying Formation(E_(3)d2L),the third member of Dongying Formation(E_(3)d_(3)),the first and second members of Shahejie Formation(E_(2)s_(1+2)),the third member of Shahejie Formation(E_(2)s_(3)).The results indicate that the E_(2)s_(1+2)and E_(2)s_(3)have better hydrocarbon generative potentials with the highest OM abundance,the E_(3)d_(3)are of the second good quality,and the E_(3)d2L have poor to fair hydrocarbon generative potential.Furthermore,the well logs were applied to predict TOC and residual hydrocarbon generation potential(S_(2))based on the sedimentary facies classification,usingΔlogR,generalizedΔlogR,logging multiple linear regression and BP neural network methods.The various methods were compared,and the BP neural network method have relatively better prediction accuracy.Based on the pre-stack simultaneous inversion(P-wave impedance,P-wave velocity and density inversion results)and the post-stack seismic attributes,the three-dimensional(3D)seismic prediction of TOC and S_(2)was carried out.The results show that the seismic near well prediction results of TOC and S_(2)based on seismic multi-attributes analysis correspond well with the results of well logging methods,and the plane prediction results are identical with the sedimentary facies map in the study area.The TOC and S_(2)values of E_(2)s_(1+2)and E_(2)s_(3)are higher than those in E_(3)d_(3)and E_(3)d_(2)L,basically consistent with the geochemical analysis results.This method makes up the deficiency of geochemical methods,establishing the connection between geophysical information and geochemical data,and it is helpful to the 3D quantitative prediction and the evaluation of high-quality source rocks in the areas where the drillings are limited. 展开更多
关键词 Total organic carbon(TOC) Residual hydrocarbon generation potential(S_(2)) Geophysical prediction Seismic attribute Bozhong sag Bohai Bay Basin
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CO_(2)对东海盆地丽水凹陷丽水36-1气田成藏的影响
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作者 郭刚 李威 《西安石油大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2024年第4期20-26,33,共8页
从宏观地质、微观地化相结合的角度对丽水西次凹丽水36-1气田进行精细解剖,揭示了丽水西次凹油气成藏规律。研究结果表明:(1)丽水西次凹灵峰组普遍发育超压,垂向上分为3个带:超压封闭箱、对流层、深部流体滞留层。(2)丽水西次凹垂向上... 从宏观地质、微观地化相结合的角度对丽水西次凹丽水36-1气田进行精细解剖,揭示了丽水西次凹油气成藏规律。研究结果表明:(1)丽水西次凹灵峰组普遍发育超压,垂向上分为3个带:超压封闭箱、对流层、深部流体滞留层。(2)丽水西次凹垂向上明显的分层结构导致构造带油气充注具有三阶段,二者之间具有良好的对应关系:底部超压封闭箱和顶部滞留层范围内包裹体均一温度分布为正常充注现象,而在中部对流层均一温度表现出幕式充注的特征。(3)丽水36-1构造带具有超压封盖、异常热流体突破改造的成藏模式。早期油气被封盖在灵峰组超压带之下,后期由于幔源岩浆的剧烈活动,幔源CO_(2)携带原生油藏向上运移,在明月峰组区域盖层的作用下聚集成藏,形成现今的丽水36-1气田。 展开更多
关键词 丽水凹陷 丽水36-1气田 超压封闭箱 油气成藏 幔源CO_(2)
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莱州湾洼陷带浅层岩性油藏富集机理与亿吨级油田新发现——以垦利10-2油田为例
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作者 杨海风 石文龙 +3 位作者 张中巧 王启明 王航 梁晓 《中国海上油气》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期23-36,共14页
针对莱州湾凹陷深洼带浅层明下段油气成藏与富集机制不明的关键问题,利用钻测井、三维地震资料等综合分析,结合古环境、现代沉积类比、地球化学指标等分析,开展了砂体展布规律、油藏运聚模式研究,揭示了莱州湾凹陷洼陷带明下段沉积古环... 针对莱州湾凹陷深洼带浅层明下段油气成藏与富集机制不明的关键问题,利用钻测井、三维地震资料等综合分析,结合古环境、现代沉积类比、地球化学指标等分析,开展了砂体展布规律、油藏运聚模式研究,揭示了莱州湾凹陷洼陷带明下段沉积古环境与规模性砂体发育机制,建立了岩性油藏油气运移和大面积岩性油藏富集模式。研究表明:(1)明下段Ⅳ油组与Ⅴ油组水生草本植物占比高,化石丰度与分异度介于湖相与河流相之间,为典型的河湖交互沉积环境;测井曲线既有反映河流相砂体的正旋回特征、湖泊作用的反旋回特征,也有正、反复合旋回特征;受河流-湖泊沉积环境频繁交互、快速转换,共同组成了大面积展布、内部广泛连通的“枝蔓式”连片砂体。(2)油气经过陡坡带深层砂体中转站聚集,再通过边界油源断层运移至浅层,最后沿着浅层连片砂体向南部高部位运移;地化指标均具有长距离的运移效应,表现为“迂回式”的成藏特点。(3)明下段岩性油藏富集机制受控于连片砂体展布范围、砂体构型与泥岩封盖能力共同控制;油气先沿河道线状充注,再向湖漫砂体面状调整,形成了浅层砂体“先枝后蔓-枝蔓互联”的大面积连片含油场面;不同期次砂体构型差异控制油气富集程度,其中“枝蔓式”连片砂体保存能力优于孤立河道砂体,最大含油幅度可达117 m。新认识成功指导发现中国深洼带浅层首个大型高产岩性油田--垦利10-2油田,突破了被传统认定为渤海浅层勘探的“禁区”,开辟了渤海湾盆地深洼带浅层大型油田发现的新局面。 展开更多
关键词 莱州湾凹陷 垦利10-2 明下段 枝蔓式 迂回式 洼陷带 勘探发现
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靶向DEC-205的弓形虫SAG1 DNA疫苗的构建及鉴定 被引量:3
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作者 林霞琳 黄春芳 +5 位作者 陈育琪 李丽娜 魏坤亚 陈欢 黄志坚 殷光文 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第20期72-75,80,159,共6页
为了构建新型弓形虫DNA疫苗并鉴定,试验以弓形虫SAG1作为疫苗候选抗原,融合小鼠树突状细胞(DC)表面分子DEC-205的单链抗体(single chain antibody fragment against DEC-205,scFv DEC-205),构建可表达弓形虫速殖子的表面抗原SAG1和scFvD... 为了构建新型弓形虫DNA疫苗并鉴定,试验以弓形虫SAG1作为疫苗候选抗原,融合小鼠树突状细胞(DC)表面分子DEC-205的单链抗体(single chain antibody fragment against DEC-205,scFv DEC-205),构建可表达弓形虫速殖子的表面抗原SAG1和scFvDEC-205-SAG1的DNA质粒,对该质粒进行酶切鉴定,同时用该质粒对真核细胞进行转染,对目标蛋白的表达情况进行鉴定。结果表明:经电泳、双酶切及测序证实目的基因大小与实际相符,重组质粒pVAX1-scFvDEC205-SAG1构建成功;经Western-blot和细胞免疫荧光试验证实重组质粒pVAX1-scFvDEC205-SAG1可成功表达目的蛋白。说明成功构建重组DNA疫苗pVAX1-scFvDEC205-SAG1并在体外表达。 展开更多
关键词 弓形虫 DNA疫苗 sag1抗原 树突状细胞 DEC-205单链抗体 重组质粒
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苏北盆地溱潼凹陷页岩油SD1井万吨级CO_(2)压吞矿场试验及效果评价 被引量:2
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作者 姚红生 宋宗旭 +3 位作者 唐建信 许国晨 邱伟生 曹聪 《西安石油大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第5期50-57,共8页
通过调研页岩油CO_(2)压吞提高采收率机理,结合SD1井地质背景和室内岩心CO_(2)吞吐实验,利用数模分析确定CO_(2)压吞最佳参数组合,最终成功进行万吨级CO_(2)压吞矿场试验,研究结果表明:SD1井脆性矿物含量较高,压裂后形成的密集缝网体系... 通过调研页岩油CO_(2)压吞提高采收率机理,结合SD1井地质背景和室内岩心CO_(2)吞吐实验,利用数模分析确定CO_(2)压吞最佳参数组合,最终成功进行万吨级CO_(2)压吞矿场试验,研究结果表明:SD1井脆性矿物含量较高,压裂后形成的密集缝网体系有利于进行大规模CO_(2)压吞试验,数模结果的注CO_(2)最小混相压力为45.14 MPa;随着驱替吞吐次数增加,页岩油动用程度逐渐增大,但增幅逐渐放缓;应选择的最优压吞参数组合为自喷后期的注入时机,1.7×10^(4)t的注入量,550~600 t/d的注气速度,50 d的焖井时间或实际井口单日压降小于0.1 MPa时开井放喷;注入CO_(2)推进方向基本不发生变化,近似向四周均匀推进,覆盖范围大,有利于提高动用程度;停注后3 d,平面波及面积为81671.04 m^(2),较停注时增加8.82%,波及体积为4316273.73 m^(3),较停注时仅增加0.1%。矿场试验表明,自喷后期大规模CO_(2)压吞能显著提高采收率。 展开更多
关键词 苏北盆地 溱潼凹陷 页岩油 CO_(2)压吞 提高采收率
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弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析 被引量:8
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作者 聂福旭 蒋蔚 +2 位作者 王权 陈永军 胡永浩 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期173-178,共6页
在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达... 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达条件进行优化,Western blotting和ELISA分析纯化蛋白的免疫原性;纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,用间接免疫荧光试验(IFA)分析表达蛋白的免疫反应性。成功构建重组质粒pET32a(+)-tSAG2,所表达的融合蛋白大小约为38kD。在IPTG终浓度为0.1mmol/L、诱导时间4-6h和培养温度32℃条件下,重组SAG2蛋白主要以可溶性形式在大肠杆菌中高效表达,每升培养菌液约获得可溶性重组SAG2蛋白16mg。Western blotting及ELISA结果显示纯化蛋白具有良好的免疫原性。IFA显示重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫表面的SAG2天然蛋白,所表达蛋白具有良好的免疫反应性。截断的SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫活性,为进一步利用该重组蛋白进行弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 sag2 蛋白表达 免疫活性
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截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量:14
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作者 言慧 李华 +2 位作者 周晓红 吴昆 陈晓光 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第4期412-414,共3页
目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET... 目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a(+)-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1抗原 大肠杆菌 可溶性 表达 纯化 免疫反应性鉴定
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弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究 被引量:11
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作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 王又红 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期8-10,共3页
目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细... 目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果 获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论 弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP1 基因表达 抗原基因 大肠杆菌
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弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达 被引量:7
14
作者 龙彩虹 吴少庭 +4 位作者 翁亚彪 高世同 张仁利 林敏 周爱琴 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期42-45,共4页
目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX... 目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论 GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫表面抗原 sag2基因片段 克隆 原核表达 免疫印迹
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弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究 被引量:7
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作者 赵焕阁 范志刚 +4 位作者 黄风迎 黄用豪 周松林 林映莹 谭光宏 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期1-5,共5页
目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5,分别通过PCR、酶切和测序鉴定后,转染人宫颈癌细胞(HeLa细胞),蛋白印迹(Westernblotting)分析重... 目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5,分别通过PCR、酶切和测序鉴定后,转染人宫颈癌细胞(HeLa细胞),蛋白印迹(Westernblotting)分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组(每组14只),分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒,每2周免疫1次,共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价,以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周,每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子,观察生存时间。末次免疫后4周,采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素(IFN-r)和白细胞介素4(IL-4)的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示,重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达,重组蛋白的相对分子质量(尬)分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1:320、1:160和1:2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高,末次免疫后2周,pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平(0.612±0.031)显著高于其他各组(P〈0.05)。攻击感染后,pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为(288±7)h,较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h(P〈0.05)。末次免疫后4周,pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[(908.52±6.31)pg/m1]显著高于其他各组(P〈0.05),各组的IL-4水平差异无统计学意义(P〉0.05)。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比,复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高,攻击感染后存活时间延长。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 复合基因疫苗 sag1-ROP5
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弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量:2
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作者 李华 言慧 +2 位作者 陈白虹 刘敏 陈晓光 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1180-1183,共4页
目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓... 目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性。结果高密度发酵诱导4h后工程菌液的OD600达到20.21;平均每升发酵液可收获工程菌26.10g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合SephadexG-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Westernblotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清呈单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%。结论利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合SephadexG-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rSAG1抗原的批量生产。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 发酵 表达 纯化
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弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究 被引量:8
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作者 李俊华 吴少庭 +7 位作者 翁亚彪 甘燕 刘洪波 刘茂玲 张仁利 高世同 黄达娜 耿艺介 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期217-221,共5页
目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每... 目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 致密颗粒蛋白4(GRA4) 表面抗原2(sag2) 重组疫苗 卡介苗(BCG) 免疫效果
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柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达 被引量:6
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作者 曹利利 姚新华 +4 位作者 郭衍冰 王英贺 任科研 魏峰 苑淑贤 《动物医学进展》 北大核心 2015年第9期13-17,共5页
为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-... 为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 sag2基因 卡介苗 表达
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弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建 被引量:5
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作者 高洋 程子英 +3 位作者 王铭 郑君 贾洪林 鲁承 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期886-890,共5页
为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或... 为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 GRA4 猫疱疹病毒I型 转移载体
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弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达 被引量:4
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作者 胡旭初 余新炳 +2 位作者 徐劲 吴忠道 陈守义 《热带医学杂志》 CAS 2002年第4期330-333,共4页
目的 分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法 在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾... 目的 分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法 在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacⅠ酶切下表达盒 ,氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16 ,通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子 ,并利用MM/MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母 ,用甲醇诱导表达 ,并分析SAG1的表达水平 ,从中筛选高表达转化子。结果 获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第 3天 ,细胞裂解液SDS PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带 ,但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少 ,而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有 4 0kDa和 2 7kDa的两种蛋白 ,后者的量大于前者 ,并与SAG1成熟肽的大小一致 ,PMD16株的表达量大于PMD11株 ,总蛋白量约 35 μg/ml。 结论 弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达 ,但PMD11宿主菌会降解外源蛋白 ,而缺失了蛋白酶的PMD16? 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 甲醇酵母 表达
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