弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论 GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。

弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究

目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。

弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析

在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达条件进行优化,Western blotting和ELISA分析纯化蛋白的免疫原性;纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,用间接免疫荧光试验(IFA)分析表达蛋白的免疫反应性。成功构建重组质粒pET32a(+)-tSAG2,所表达的融合蛋白大小约为38kD。在IPTG终浓度为0.1mmol/L、诱导时间4-6h和培养温度32℃条件下,重组SAG2蛋白主要以可溶性形式在大肠杆菌中高效表达,每升培养菌液约获得可溶性重组SAG2蛋白16mg。Western blotting及ELISA结果显示纯化蛋白具有良好的免疫原性。IFA显示重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫表面的SAG2天然蛋白,所表达蛋白具有良好的免疫反应性。截断的SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫活性,为进一步利用该重组蛋白进行弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。

柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达

为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。

弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

目的在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗。方法以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)分析。以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应。结果成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白。Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因。整体重组酵母活菌具有免疫原性。

弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护性

目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒。ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定免疫鼠脾脏NK细胞杀伤率;流式细胞仪测定T细胞亚群;用弓形虫速殖子腹腔攻击感染小鼠,观察小鼠的生存时间。结果SAG1-SAG2组小鼠IgG抗体、IFN-γ、IL-2及CD4+/CD8+细胞比例均高于SAG1组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合DNA疫苗组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗较SAG1单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的克隆与序列分析

根据已发表的柔嫩艾美耳球虫(Houghton株)基因序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,将扩增的片段连入pMD18T载体,筛选阳性克隆进行测序和序列分析。结果表明,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,测得ORF全长813bp;与GenBank中收录的Houghton株柔嫩艾美耳球虫的SAG2基因序列相比,有4个碱基发生变异,两者的核苷酸序列同源性为99.50%;柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的推导氨基酸序列同源性为99.63%,其中,A185G变异导致了编码氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸(E62G),A247T变异导致了编码氨基酸由蛋氨酸变为亮氨酸(M83L),而其他核苷酸的突变为无义突变;SAG2抗原的N端和C端疏水性较强,并且N端前23个氨基酸为跨膜信号肽区,而中间有许多亲水性区域,且显示很强的抗原性。柔嫩艾美耳球虫长春株与Houghton株的SAG2基因编码蛋白相似性很高,具有很强的抗原性,可以作为球虫疫苗的候选抗原来进一步研究。

弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。

SAG2基因片段的体外扩增及在孕妇弓形虫感染诊断中的应用

目的 根据弓形虫表面抗原SAG2基因序列 ,设计弓形虫特异性引物一对 ,采用聚合酶链反应技术 ,进行弓形虫感染的检测。结果 从弓形虫DNA提取物中扩增出 5 93bp的基因片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ;与弓形虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、间日疟原虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带 ;该检测体系至少可检测出相当于每 μl血样中 2个弓形虫的水平 ;将该检测体系用于临床孕妇产前诊断 ,5 6份标本中检查出 3例。结论 所建立弓形虫PCR检测体系灵敏、特异 ,适用于孕妇弓形虫感染的诊断。

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的 构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。 方法 设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。 结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。 结论 真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。

刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。

蜥蜴利什曼原虫表达柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的保护效果检测

本试验将已构建的PLEXSY-neo2-SAG2在蜥蜴利什曼原虫中表达,以皮下注射的方式免疫雏鸡,经检测各组体液和细胞免疫水平、OPG、相对增重率及ACI等指标,对重组蛋白的抗球虫保护效果做出评价,为制备相关疫苗的研究奠定基础。

弓形虫pVAX1-SAG2真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答

目的 构建弓形虫主要速殖子表面抗原 2 (SAG2 )编码基因真核表达质粒pVAX1-SAG2 ,并接种小鼠 ,分析其所诱导的免疫应答。方法 以限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切从重组质粒 pGEM/SAG2中获得SAG2目的基因片段 ,约5 92个bp ,将其插入真核表达载体 pVAX1多克隆位点 ,构建重组质粒 pVAX1-SAG2 ,并转化大肠杆菌JM 10 9,阳性克隆以双酶切与PCR法鉴定。大量提取纯化重组质粒 pVAX1-SAG2 ,5 0 μg肌肉注射小鼠左后腿内侧肌肉 ,3周后加强免疫一次 ;RT-PCR检测SAG2在小鼠肌肉中的转录表达 ,流式细胞仪测定T细胞亚群 ,以速殖子虫体抗原作ELISA测定小鼠血清IgG抗体。结果 真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符合。RT -PCR从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带 ;重组质粒 pVAX1-SAG2免疫组CD+ 4 细胞数为 32 .35± 5 .38,显著高于空质粒pVAX1及生理盐水 (NS)二对照组 (P <0 .0 1) ,后二者CD+ 4 细胞数分别为 19.6 5± 4 .2 1与 17.84± 1.5 9;免疫组CD+ 8细胞数为 18.6 7± 2 .37,但与空质粒及NS对照组相比 ,差别不显著 (P >0 .0 5 )。ELISA测定结果显示 pVAX1/SAG2免疫组小鼠血清中出现抗弓形虫特异性IgG抗体。结论 构建成功SAG2真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2 。

弓形虫上海株SAG2基因克隆和序列分析

目的:对弓形虫上海株SAG2基因进行克隆与鉴定。方法:采用PCR方法从弓形虫上海株总DNA中扩增到SAG2基因,与pGEM-T-easy vector连接,并进行DNA测序分析。结果:用DNAStar软件对扩增出的片断与GenBank上的7个虫株相应的序列进行同源性比较,不同宿主和不同区域上的弓形虫SAG2基因序列差异很小。结论:用基因重组技术获得的SAG2抗原,作为候选疫苗和诊断抗原,有着广阔的发展前景。

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。

云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的SAG2基因位点分析

目的初步了解云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型特征。方法使用基因提取试剂盒提取龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因,运用巢式PCR技术分别对弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)进行扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪下观察结果。用DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并进行酶切,酶切产物置于37℃恒温培养箱孵育16h,孵育后的酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像观察结果并与弓形虫基因Ⅰ型标准株进行对比鉴定。结果 112份HIV阳性者全血37份扩增出弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)。从37份弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)扩增阳性的全血标本中选择条带较亮的6份进行酶切,并与弓形虫基因I型标准株比对,初步确定2号标本为基因Ⅲ型,其他标本为基因Ⅰ型。从酶切的6份标本中选择2份进行测序,其中1份为酶切Ⅲ型(测序的2号标本)。经过基因序列对比分析,各弓形虫株之间SAG2基因的碱基对差异较小。其中基因Ⅰ型36份,Ⅲ型1份。结论初步确定云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型以Ⅰ型为主,Ⅲ型少见,未见Ⅱ型及其他基因型。

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAGSAG2基因位点分析

目的初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基因的两个片段分别进行基因提取、扩增,然后对PCR产物进行回收纯化、酶切及测序,并与弓形虫基因I型标准株进行对比鉴定。结果从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因(241、221 bp),从其中扩增阳性的全血样本中各选择4份分别进行酶切,扩增出目的基因片段,进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进行对比,酶切SAG2基因(241 bp)显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型,酶切SAG2基因(221 bp)确定基因型均为Ⅰ型。结论初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。

抗弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗弓形虫SAG2蛋白的单克隆抗体(McAb),用纯化的rSAG2蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选稳定分泌高效价McAb的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单抗。用ELISA方法测定其效价;单克隆抗体类型鉴定试纸条鉴定其类型;Western-blot和IFA试验进行特异性鉴定。结果显示,筛选出2株能稳定分泌抗SAG2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5E2、2A8。间接ELISA测定其效价分别为1∶256 000、1∶128 000;2株单克隆抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链;Western-blot与IFA试验表明,这2株McAb均能够特异性识别天然构象的SAG2蛋白,并且进一步说明此蛋白是位于弓形虫膜表面的蛋白。成功获得了具有较高特异性及敏感性的抗SAG2蛋白的单克隆抗体,并能特异性识别天然构象的SAG2蛋白,为弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。