白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA,以其为模板采用聚合酶链反应(PCR)法获取SAP2基因,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC和SAP2基因行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶纯化,连接酶切产物,转化TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisC,电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3.1/SAP2重组质粒,该质粒能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。

含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因对肝细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制

目的探讨含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因(MAMSTR)对肝细胞癌(HCC)预后的影响,以及对HCC细胞增殖和凋亡的作用和可能机制。方法从TCGA数据库中获取369例HCC患者肿瘤组织和正常肝组织mRNA数据和相应临床信息。通过Wilcoxon检验分析MAMSTR基因在HCC组织和正常肝组织中的表达差异。通过Kaplan-Meier曲线和Cox回归模型分析MAMSTR与HCC患者预后的关系。应用基因功能富集分析(GSEA)检测MAMSTR在HCC中的潜在生物学功能。使用慢病毒包装质粒构建可诱导表达MAMSTR siRNA的HepG2肝癌细胞系。通过细胞计数、克隆形成和Caspase 3活性实验检测体外条件下MAMSTR对HCC细胞生长和凋亡的作用。使用蛋白质印迹、定量PCR实验分析MAMSTR影响HCC细胞凋亡的分子机制。通过转录因子分析MAMSTR对HCC生物学功能调控的可能信号通路。结果与正常肝组织比较,MAMSTR基因在HCC组织中高表达,P<0.001;且其表达量与年龄和临床分期有关联,均P<0.05。生存分析显示,高表达MAMSTR组患者中位生存期较短,χ^(2)=14.257,P<0.001。单因素(HR=1.302,95%CI为1.160~1.461)和多因素Cox回归模型(HR=1.265,95%CI为1.124~1.424)表明,MAMSTR可以作为HCC患者预后的独立危险因子,均P<0.001。单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析发现,MAMSTR高表达组中CD56dim自然杀伤细胞(W=536,P=0.018)、效应记忆CD8+T细胞(W=576,P=0.048)、嗜酸性粒细胞(W=305,P<0.001)、1型辅助性调节T细胞(W=497,P=0.006)和17型辅助性调节T细胞(W=439,P<0.001)抗肿瘤免疫细胞出现下调。同时,促肿瘤免疫细胞记忆B细胞(W=1010,P=0.022)和2型辅助性调节T细胞(W=1191,P<0.001)上调。GSEA结果显示,MAMSTR可能调控E2F转录因子[标准化富集分数(NES)=2.475,P<0.001]、PI3K/Akt/mTOR(NES=1.438,P=0.002)等信号通路。定量PCR检测发现,敲低组细胞MAMSTR的相对表达量(0.624±0.006)明显低于对照组(1.000±0.010),差异有统计学意义,t=45.998,P<0.001。生长计数和克隆形成实验发现,敲低MAMSTR表达可以抑制HepG2细胞生长,t=11.372,P=0.008。Caspase 3活性实验结果显示,Dox(+)组细胞中Caspase 3相对活性(2.209±0.027)明显高于Dox(-)组(1.000±0.017),差异有统计学意义,t=66.576,P<0.001。蛋白质印迹实验验证了在敲低MAMSTR表达的HepG2细胞中,PUMA蛋白在Dox(+)组(1.390±0.018)中相对于Dox(-)组(0.988±0.030)表达上调,差异有统计学意义,t=16.270,P=0.004;BCL2蛋白在Dox(+)组(0.565±0.005)相比Dox(-)组(1.046±0.038)表达下调,差异有统计学意义,t=17.635,P=0.003。定量PCR实验显示,BAX基因在Dox(+)组中相对表达量(1.415±0.055)明显高于Dox(-)组(1.000±0.020),差异有统计学意义,t=9.969,P=0.010。转录因子分析表明,MAMSTR可能通过E2F1参与调控细胞生长,相关E2F1蛋白转录结合域包括cisbp_M3134、transfac_pro_M00920和transfac_public_M00516等。进一步分析发现,E2F1与MAMSTR表达呈正相关,r=0.566,P<0.001。结论MAMSTR基因是促进HCC进展和导致HCC患者预后不良的可能因素之一,其可能通过调节E2F1转录因子网络进而调控HCC细胞增殖和凋亡。