SARS冠状病毒3CL蛋白酶及其抑制剂的理论研究

应用AutoDock程序将SARS冠状病毒3CL蛋白酶及其抑制剂配体和受体进行了对接,并用InsightⅡ中的Discover3模块进行了分子动力学模拟,分析了蛋白酶活性口袋的形状,讨论了其亚基的氢键、静电、疏水等相互作用,为进一步设计药物提供了重要的参考信息.

非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的设计与活性表征

SARS冠状病毒3CL蛋白酶是SARS病毒复制过程中的主要蛋白酶,针对其开展药物设计有望得到有效的抗SARS病毒药物.本文基于SARS冠状病毒3CL蛋白酶的三维结构,对现有化学试剂及临床用药数据库进行虚拟筛选,选出可能对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的非肽化合物进行初步活性测试,并研究了已知的人鼻病毒3C蛋白酶抑制剂对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性,合成了两种母环的衍生物,得到靛红和哌嗪两类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂,其中一个靛红类化合物的IC50为0.76μmol·L-1;而抗组胺药哌嗪类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶及细胞培育的SARS病毒的抑制作用,提示了老药可以开发出新的用途.

SARS冠状病毒半胱氨酸蛋白酶3CL^(pro)的克隆表达及分离纯化(英文)

SARS(严重急性呼吸综合征)是由一种新型的人类冠状病毒引起的。由于SARS冠状病毒3CL蛋白酶在病毒的复制翻译中起关键作用,所以成为抗SARS药物设计的关键靶标之一。该研究中,利用以pET28a为载体的高效原核表达系统,克隆表达出SARS冠状病毒3CL蛋白酶,然后由NTA-Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行分离纯化。3CL蛋白酶在大肠杆菌表达系统中的成功表达为今后进一步筛选抗SARS病毒药物奠定基础。

SARS冠状病毒蛋白酶3CL^(pro) N-finger多肽是酶活性所必需(英文)

构建了 SARS冠状病毒主要蛋白酶3CLpro 及其缺失N 端七肽即N-finger的突变体3CLpro(?1–7)融合表达质粒,并于大肠杆菌表达系统中表达。得到的融合蛋白经肠激酶酶切,亲和层析,最终得到纯化的3CLpro及其突变体 3CLpro(?1–7)。酶活性实验显示,去除 N-finger多肽的突变体3CLpro(?1–7)丧失了3CLpro所具有的对含有其自动水解位点的荧光底物的水解活性,表明处于非酶活性中心的N-finger 多肽是酶活性所必需的。利用固相合成法,进一步合成了N-finger七肽。酶抑制实验表明N-finger七肽表现了对3CLpro 部分竞争抑制活性。

SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的结构与功能

SARS冠状病毒基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶(PLpro)和3C样蛋白酶(3CLpro).其中,PLpro蛋白酶结构与功能研究是近年来冠状病毒分子生物学研究的热点之一.PLpro蛋白酶参与SARS冠状病毒1a(1ab)复制酶多聚蛋白N端部分的切割加工,是SARS冠状病毒复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子;最新研究表明,SARS冠状病毒PLpro蛋白酶是一种病毒编码的去泛素化酶(DUB),对细胞蛋白具有明显去泛素化作用;而且对泛素(Ub)和泛素样分子ISG15均具有活性.PLpro蛋白酶对宿主抗病毒天然免疫反应具有负调节作用,是SARS冠状病毒的一种重要干扰素拮抗分子.PLpro蛋白酶是一种多功能病毒蛋白酶.本文结合作者课题组研究工作,对SARS冠状病毒PLpro蛋白酶结构和功能研究最新进展进行综述.

SARS冠状病毒PLpro蛋白酶对泛素样分子的DUB活性

SARS冠状病毒基因组中非结构基因nsp3编码的木瓜样蛋白酶(PLpro)在病毒基因组复制及逃避宿主天然免疫中发挥重要作用,是研发抗病毒药物的重要靶标.SARS冠状病毒PLpro是一种病毒编码的去泛素化酶(DUB).为深入研究SARS冠状病毒PLpro对泛素样分子(ubiquitin-likeprotein,UBL)的DUB特性,本研究构建缺失PLpro N末端泛素样结构域(Ubl)和下游跨膜结构域(TM)的PLpro构建体(constructs),并构建3种缺失蛋白酶催化活性的突变体,检测PLpro对泛素样分子干扰素刺激基因15(ISG15)及SUMO-1的作用.实验结果表明,PLpro和PLpro-TM在细胞内具有很强的去ISG(DeISGylation)活性;缺失PLpro N末端泛素样结构域(Ubl)对PLpro的去ISG15活性没有影响;对PLpro蛋白酶活性位点C1651和H1812突变后,PLpro-TM的去ISG15活性消失,而对D1826位点突变后不影响此活性.PLpro不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性,而PLpro-TM具有一定的去SUMO活性;PLpro催化活性相关的3个关键氨基酸残基Cys-His-Asp突变后对去SUMO活性有一定的影响.研究结果提示,SARS PLpro除了具有DUB的活性,还具有体内去ISG活性和去SUMO活性;PLpro蛋白酶活性与其去ISG活性之间有一定相关性;PLpro去SUMO-1活性具有TM依赖性.SARS冠状病毒PLpro对泛素样分子作用特性的研究为阐明病毒逃避宿主天然免疫机制和开发新型抗病毒药物提供重要的理论依据.

SARS冠状病毒主要蛋白酶二聚体静电和疏水效应的研究

从三种冠状病毒主要蛋白酶SARS 3CL ,HCoV 3CL和TGEC 3CL蛋白酶结构出发 ,着重研究了三种蛋白酶二聚体单体之间的静电和疏水相互作用 .用连续介质模型有限差分方法计算得到三种蛋白二聚体界面处的静电势 ,发现三种蛋白酶单体和单体之间静电势分布具有明显的互补性 ,三种蛋白酶二聚体单体之间具有相同的静电相互作用能 .用溶剂可及表面积模型分析了分子表面积及疏水性 ,发现三种蛋白酶具有相同的疏水分布 ,其中SARS 3CL蛋白酶疏水率为 74% ,驱动其单体聚合成二聚体 .对三种蛋白酶的去溶剂化能疏水项的计算表明 ,三种蛋白酶二聚体单体之间具有相似的疏水相互作用能 .

SARS冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性

SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性.实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15(DeISGylation)活性.研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro.但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性.SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础.

SARS冠状病毒N蛋白和CYP4F3的相互作用

目的:研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白与CYP4F3的相互作用。方法:应用免疫共沉淀、GST-pulldown、BIACORE实验验证SARS-CoVN蛋白与CYP4F3的相互作用。结果:SARS-CoVN蛋白与CYP4F3能够相互作用,BIA-CORE实验证实CYP4F3与SARS-CoVN蛋白的亲和常数为KD=4.3×10-11。结论:SARS-CoVN蛋白与CYP4F3在细胞内、外均能形成复合物,这为进一步探讨SARS-CoVN蛋白在SARS致病机理中的作用奠定了基础。

SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用

用新近发展的冠状病毒的基因解析软件系统ZCURVE -CoV 1 .0和ZCURVE -CoV 2 .0(http ://tubic .tju .edu .cn/sars/)分析了基因库 (NCBIRefSeqproject)中的 2 7个不同来源的SARS冠状病毒的RNA基因序列 ,找出了主蛋白酶 (CoVMpro)在聚蛋白pp1a和pp1ab中的 2 97个酶切位点 .在此基础上确定的 1 1个SARS冠状病毒主蛋白酶的可切割八肽 .这些八肽都含有SARSCoVMpro 的真实切割点 ,因而是发展SARSCoVMpro的多肽类抑制剂的适宜出发点 .计算了可切割八肽在特异性位点R2、R1、和R1上的氨基酸的分布概率 ,发现位点R4和R3也有一定的特异性 .分析了这些位点上的氨基酸的结构特征 ,找出了最有希望成为SARSCoVMpro的多肽类抑制剂的两个八肽NH2 -ATLQ↓AIAS-COOH和NH2 -ATLQ↓AENV -COOH ,并探讨了对可切割八肽作化学修饰的思路 ,为SARSCoVMpro的多肽类抑制剂和非肽类抑制剂的设计提供了基础 .同时把生物信息学用于药物开发 。

4株SARS冠状病毒中国分离株3′非编码区的序列测定及分析

分别对 4株SARS冠状病毒中国株基因组 3′非编码区序列进行测定和分析 ,然后应用Blast、DNAstarGeneQuest等软件对中国株的这段序列与其它SARS和非SARS冠状病毒的序列进行比较 .结果显示 ,所测 4株SARS冠状病毒中国分离株的 3′非编码区长度均为 339nt,与其它已测序SARS冠状病毒的相应序列完全一致 .SARS冠状病毒的非编码区含有冠状病毒保守的“伪结”结构 .在距末端 138nt处还存在 1个长约 32nt的Ⅱ型茎 环结构的序列 ,该序列在其它已知人冠状病毒中并不存在 ,而与禽传染性支气管炎病毒和星状病毒中的对应序列高度同源 .

SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析

目的 :克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框 ,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法 :通过RT PCR ,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段 ,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果 :RT PCR扩增出的特异产物与预期长度相符 ,序列分析表明 ,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在 99%以上。结论 :成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框 ,为表达及功能研究奠定了基础。

组蛋白酶抑制剂阻止SARS冠状病毒侵入细胞

据Medscape．com8月1日报道（原载PNAS USA 2005），利用一种对PH值敏感的内体蛋白酶-组蛋白酶L抑制剂，可以预防冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症（SARS）。

感冒229E病毒3CL蛋白酶抑制剂金丝桃苷衍生物的合成及其构效关系研究

目的寻找作为感冒229E抗原型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的新化学结构。方法运用分子对接方法在ACD化合物库中发现天然产物金丝桃苷是潜在的新型抑制剂,借助分子模拟的方法进行结构改造,设计并合成了5个金丝桃苷衍生物,采用表面等离子共振(SPR)法测试这些化合物与该蛋白酶的结合能力。结果与结论衍生物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与蛋白酶的结合能力比原天然产物Ⅰ提高了3倍以上,它们的结合构象也明显不同于Ⅰ与SARS病毒3CL蛋白酶的结合构象。这些结合模式的差异为设计选择性更好的感冒病毒3CL蛋白酶抑制剂提供了有益的参考信息。将计算机辅助药物分子设计、有机合成和生物活性测试有机地结合起来,是发现和设计感冒229E型病毒3CL蛋白酶新型选择性抑制剂的有效途径。

SARS冠状病毒基因组复制酶起始结合位点的预测

严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)传染性强,死亡率高, 给全世界约30个国家造成了巨大损失.其病原体为SARS冠状病毒(Severe acute Respiratory Syndrome Associated Coronavirus,SARS—CoV),是冠状病毒(Coronavirus)的新变异种.作者以“最大信息量”理论和方法为基础,使用结合位点搜寻软件等生物信息学方法,对冠状病毒基因组的3’非翻译区(Untranslated Regions,UTRs)进行分析,预测出了2株SARS—CoV(来自北京的SARSBJ01和浙江的SARSZJ01)以及其他38株冠状病毒株的复制酶起始结合位点(Rep- licase initial binding sites,RIBS).在该预测结果中,不难发现,这些RIBS的序列与前人的研究成果有很大的相似之处,与公认的冠状病毒的顺式作用元件极为相似的基序也存在其中,而且其预测的二级结构与鼠肝炎病毒MHV基因组的某些蛋白结合位点类似.因此,预测的RIBS 在病毒的复制中可能起重要作用.

SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及抑制动力学研究

对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-Co V M^(pro))进行异源重组表达与提纯,并以其为靶点,利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型, 对蛋白酶抑制剂聚焦库96种化合物进行了体外抑制活性的评价,并从动力学的角度探讨筛选出的阳性化合物对SARS-CoV M^(pro)的抑制能力与机制。结果表明:通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物5种,为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54,其半数有效抑制浓度(IC_(50))分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。其中化合物P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制,化合物P-2-28的抑制作用为可逆抑制。根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC_(50)值及Ki值关系的研究,进一步验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。

SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究

目的 构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原。方法 采用RT PCR从SARS冠状病毒北京0 1(BJ0 1)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D2 3;构建重组真核表达质粒pcDNA3 /D12、pcDNA3 D14、pcDNA3 D2 /3;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51 Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN -γ分泌。结果 pcDNA3 /D2 3疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>10 0 0 ;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN γ分泌,pcDNA3 /D2 3疫苗组与其它组之间统计分析P <0 .0 5。结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料。