SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录 PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白 (N)和膜蛋白 (M)基因 ,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET2 2b和pBV2 2 2上 ,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性 。

SARS病毒基因组所编码的E蛋白的二级结构和B细胞表位预测

目的 预测SARS病毒E蛋白的B细胞表位和二级结构。方法 以SARS病毒基因组序列为基础 ,采用Gar nier Robson方法、Chou Fasman方法和Karplus Schultz方法预测E蛋白质的二级结构 ;用Kyte Doolittle方案预测蛋白质的亲水性 ;用Emini方案预测蛋白质的表面可能性 ;用Jameson Wolf方案预测氨基酸的抗原性指数。综合评判 ,预测SARS病毒E蛋白的B细胞表位。结果 在SARS病毒E蛋白N 端的第 1～ 6、13～ 19、39～ 4 3、4 7～ 6 4区段和第 73～ 76区段有 β 折叠中心 ;第 6～ 12区段和第 6 7～ 6 9区段可能形成转角或无规则卷曲 ,是柔性区域。E蛋白N端第 2～ 13区段和第 6 1～ 74区段为B细胞优势表位区域。结论 用多参数预测SARS病毒E蛋白的二级结构和B细胞表位 。

用小世界网络模型研究SARS病毒的传播

用小世界网络模型对非典型肺炎的传染动力学行为做了数值模拟研究。在传染模型中加入了负反馈机制与信息流效应。我们的模拟结果成功地得到了和现实病毒扩散相同的趋势。我们的主要研究结果是 :负反馈机制可以有效地抑制非典型肺炎的蔓延 ,但在某些情况下可能引起感染人数的反复性振荡。另外 。

金振口服液对SARS病毒抑制作用的实验研究

目的观察金振口服液对VeroE6细胞内SAILS相关冠状病毒的抑制作用。方法取一定量的SAILS相关冠状病毒BJ-01株加入培养好的VeroE6细胞中，置37℃、5％CO2培养箱吸附2h，吸出病毒液，再分别加入不同浓度的药物稀释液，在同样条件下培养4～5d，观察细胞病变情况。结果金振口服液抑制冠状病毒半数有效浓度（IC劬）为2．0μg/mL，治疗指数（TI）为35。结论金振口服液对SAPS病毒有较好的抑制作用。

SARS病毒S2基因的克隆、表达、纯化及其免疫学特性研究

目的 :在大肠杆菌中表达SARS病毒S2与硫氧还原蛋白 (Trx)的融合蛋白 ,并对其进行血清学鉴定。方法 :克隆编码SARS病毒S2蛋白的基因 ,并在原核表达系统中表达了 6×His S2硫氧还原融合蛋白。用Westernblot分析纯化Trx S2融合蛋白 ,分别与 6份SARS流行前的正常人血清和 6份SARS患者恢复期血清的反应性。结果 :Westernblot分析表明 ,6份SARS患者的恢复期血清均能识别Trx S2融合蛋白 ,且在Mr为 76× 10 3 附近出现特异性的结合带 ;而 6份SARS流行前的正常人血清则不与Trx S2融合蛋白起反应。结论 :本研究获得了纯化的SARS病毒Trx S2融合蛋白 ,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性结合反应 ,为研究SARS病毒感染宿主细胞的过程和制备针对SARS病毒的重组疫苗提供了条件。

阿比多尔抗SARS病毒的体外实验研究

目的 观察抗流感病毒药物阿比多尔 (arbidole)体外抗SARS -CoV作用。方法 以利巴韦林作为阳性对照药 ,采用MTT法和细胞病变 (CPE)法 ,观察阿比多尔对SARS -CoV的抑制作用。结果 MTT法测得阿比多尔对细胞的最大无毒浓度为10 μg·ml-1,对SARS -CoV的IC50 为 7.14 μg·ml-1,治疗指数TI为 1.77。阳性对照药利巴韦林的IC50 为 6 6 .1μg·ml-1,治疗指数TI>6 .1。结论 阿比多尔在体外对SARS -CoV有抑制作用。

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的 预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位。方法 基于SARS蛋白基因组序列 ,采用Kyte Doolittle的亲水性方案 ,Emini方案和Jameson Wolf抗原指数方案 ,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析 ,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位。结果 推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第 91～ 98区段、第 112 1～ 115 3区段和第 185～ 193区段内或它们的附近。其它 ,如S蛋白N端第 10 5 0～ 10 5 9、75 2～ 765、41～ 5 0、666～ 674、2 64～ 2 87、3 40～ 3 48、40 8～ 416区段和第 42 4～ 43 9区段内或附近也可能存在B细胞表位。结论 用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位 。

SARS病毒对温度耐受性的实验研究

为观察SARS病毒在冷藏和自然温度下的稳定性以及灭活SARS病毒的有效温度,将SARS病毒培养的上清液(106TCID50)分装到10 ml离心管中,放置在4℃冰箱、室温(24.5℃)、37℃、56℃和70℃水浴中,间隔一定时间以后取样0.5 ml,接种Vero-E6细胞.结果,SARS病毒在冷藏和室温条件下十分稳定,冷藏(4℃)放置10 d,滴度只下降大约2个log,室温放置5 d,滴度下降大约4个log,仍然保持较高的感染性.加热时SARS病毒的滴度迅速下降,56℃加热30 min、70℃加热15 min检测不出有活病毒.结论,SARS病毒在冷藏和自然温度下十分稳定,加热是灭活SARS病毒简单有效的方法.

SARS病毒及其流行特征

2002年11月,广东省佛山市首发一起家族聚集传染性非典型肺炎事件,自此以后全球共有32个国家和地区发现了类似病例,世界卫生组织(WHO)于2003年3月12日发出疫情警报,将其称为严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS).WHO在2003年7月11日公布的资料显示全球共发现8437名SARS病例,其中死亡813人[1,2].中国是疫情最严重的国家,有26个省市、自治区、直辖市共发现了5327名SARS病例,死亡348人,北京市和广东省的病例数最多.截至到7月19日,北京市共发现确诊SARS病例2521人,死亡192人[3].

SARS病毒在外界环境物品中生存和抵抗能力的研究

评估SARS病毒离开人体以后在外界环境物品中生存的能力.采用的方法是将滴度为106]TCID#-的SARS病毒BJ-01株涂布在灭菌的不锈钢片、玻璃片、塑料片、滤纸片、棉布片和木片的表面,或混合在灭菌自来水和土壤样品中,经一定时间后洗下病毒,接种Vero-E6细胞,观察细胞病变.结果,SARS病毒在模拟污染的不锈钢片、玻璃片、塑料片上可以存活至少2 d,在模拟污染的棉布片、土壤、滤纸片和木片上至少可存活4～6 h,在污染的自来水中2 d仍然保持较强的感染性.干燥是影响SARS病毒生存时间的重要因素.结论,SARS病毒离开人体以后在外界环境物品中具有较强的生存能力,做好对环境物品的消毒对于切断传播途径十分重要.

利用参比型SPR生物传感器进行SARS病毒抗原检测的研究

参比型SPR生物传感器是一种可以在单通道内实现对检测、参比两个位点同时检测的新型SPR分析系统.利用参比型SPR生物传感器在线制备了两种SARS病毒抗原的检测芯片.直接固定抗体法制备的检测芯片在检测时基本无反应;蛋白A固定抗体法制备的芯片在通入灭活SARS病毒时检测信号明显,参比信号略有上升.第二种芯片可以直接检测到病毒培养液上清中的灭活SARS病毒,检测灵敏度已达到1.66×104PFU/mL.参比位点可以用来检测待测物中杂质引起的非特异性吸附.

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。

重组人干扰素βSer^(17)的制备及其对SARS病毒的抑制作用

目的制备重组人干扰素-βSer17(rhIFN-βSer17),并检测其对SARS病毒的抑制作用。方法通过发酵收集菌体,经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、柱层析纯化重组蛋白,通过细胞病变抑制法检测其对SARS病毒的抑制作用。结果研制的rhIFN-βSer17的纯度超过95%,比活性超过2.0×107IU/mg蛋白,在体外对SARS病毒具有明显的抑制作用。结论已成功制备rhIFN-βSer17,并在体外对SARS病毒具有抑制作用。

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。

SARS病毒基因及蛋白系统分析

目的 :分析比较SARS病毒与冠状病毒科中病毒基因和蛋白的同源性。方法 :利用互联网、分子生物学软件对SARS病毒与冠状病毒科中病毒基因和蛋白同源性分析 ,构建蛋白进化树。结果 :SARS病毒在某些区域基因序列与冠状病毒存在相当大的差异 ,具有自身比较保守的基因组序列结构。SARS病毒的三个结构蛋白 (S、M和N)中与同科其他病毒存在很高的同源性 ;不同地域SARS病毒的基因序列存在差异。结论 :SARS病毒不是其他冠状病毒的变异体 ,而是一种与冠状病毒类似 ,可能早已经独立存在 。

臭氧水对SARS病毒的灭活效果观察

为了观察电解法产生的臭氧水对SARS病毒的灭活效果,采用悬液灭活试验法进行了试验。结果,以臭氧含量为27.73mg/L,作用4min可完全灭活SARS病毒;以臭氧含量为17.82mg/L,作用4min和4.86mg/L作用10min,均可使SARS病毒的灭活率达100％。结论,电解法产生的臭氧水含臭氧量达到4.86mg/L以上,对悬液内SARS病毒具有很强的灭活效果。

SARS病毒M蛋白的二级结构和B细胞表位预测

以SARS病毒基因组序列为基础 ,采用Garnier Robson方法、Chou Fasman方法和Karplus Schulz方法预测蛋白质的二级结构 ;按Kyte Doolittle方案、Emini方案和Jameson Wolf方案预测SARS病毒M蛋白的B细胞表位。预测结果表明 ,在SARS病毒M蛋白N 端第 1 1～ 2 0、2 7～ 36区段和第 1 33～ 1 41区段可能是α 螺旋中心 ;M蛋白分子N 端第 2 0～ 2 7、34～ 37,44～ 5 6,61～ 64,70～ 76,79～ 97,1 1 7～ 1 32 ,1 42～ 1 47,1 65～ 1 76区段和第 2 1 6～ 2 2 1区段可能是β 折叠中心。在M蛋白N 端第 5～ 6、40～ 44、1 0 5～ 1 0 7、1 1 2～ 1 1 6、1 89～ 1 90、2 0 2～ 2 0 3区段和第 2 1 0～ 2 1 5区段具有较柔软的结构 ,有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。SARS病毒M蛋白N 端第 1～ 1 5、37～ 47、99～ 1 2 0、1 81～ 1 92区段和第 1 96～ 2 1 5区段内或附近很可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段 ,用抗原指数 ,亲水性参数和可及性参数预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位 。

细胞密度和感染复数对SARS病毒在Vero细胞中增殖的影响

阐明宿主细胞密度和病毒感染复数(MOI)对SARS冠状病毒增殖的影响,为SARS灭活疫苗的研究奠定基础。采用析因设计方法,考虑MOI(0.01、0.05和0.1)与细胞密度(2×104、4×104和8×104/cm2)2个3水平实验因素,在各水平组合条件下培养SARS病毒,以组织培养半数感染量(TCID50)作为观测指标,分析SARS冠状病毒滴度在不同增殖条件下的差异。结果表明,MOI、宿主细胞密度和二者之间的交互作用对SARS病毒滴度的影响分别具有非常显著性差异(F=12.70,P<0.01)、显著性差异(F=6.94,P<0.05)和非常显著性差异(F=8.22,P<0.01)。在0.01MOI和8×104/cm2条件下,病毒滴度达5.57×105TCID50/mL。说明SARS冠状病毒在培养细胞中的增殖能力显著依赖于宿主细胞密度、病毒感染复数和二者的交互作用。