抑癌基因SASH1在乳腺癌中结合Vimentin并负性调节Vimentin的表达

目的寻找参与抑癌基因SASH1调节乳腺癌发生发展的伙伴分子,并分析两者的相关性以及在乳腺癌发生发展中的作用。方法利用液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)技术和免疫共沉淀技术分析与SASH1结合并可能调节乳腺癌发生发展的分子。免疫组织化学和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测30例正常乳腺组织和123例乳腺癌组织SASH1和波形蛋白(Vimentin)的表达水平,并在乳腺癌中分析两者之间的相关性。Western blot检测乳腺癌细胞中敲低SASH1对Vimentin表达的影响。结果SASH1与Vimentin存在相互作用的可能性为100%。免疫共沉淀证实SASH1与Vimentin可发生蛋白相互作用。免疫组织化学染色结果显示,与正常乳腺组织相比,乳腺癌组织中SASH1表达降低而Vimentin表达增高,且两者呈负相关(P<0.01)。Western blot实验证实在16例乳腺癌组织和对应的癌旁组织中,乳腺癌组织表现出SASH1低表达,而Vimentin高表达。在乳腺癌细胞中敲低SASH1后Vimentin的表达增高。结论SASH1可能通过负性调节Vimentin的表达参与乳腺癌的发生发展。

SASH1通过MAP2K2和MAP4K4与ERK信号通路交互作用

目的探讨新候选抑癌基因SASH1与细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的两个关键分子MAP2K2和MAP4K4的蛋白-蛋白相互作用关系。方法用XhoⅠ和HpaⅠ构建SBP-Flag-SASH1-p BABE-puro反转录病毒载体,转染HEK-293T细胞,通过嘌呤霉素筛选出稳定表达外源性SASH1基因的细胞系。Western blot检测外源性Flag-SASH1蛋白表达,利用pull-down实验、质谱技术、免疫沉淀鉴定和分析与SASH1结合的并可能调节细胞增殖、转移和凋亡等的关键蛋白。用SASH1-siRNA1和SASH1-siRNA2分别转染MDA-MB-231细胞系,以空白组和Negative-siRNA组为对照。72 h后Western blot检测SASH1的干扰效果和P-ERK1/2水平。结果成功构建稳定表达SBP-Flag-SASH1-p BABE-puro重组质粒的HEK-293T细胞系,SASH1与MAP2K2和MAP4K4结合并发生相互作用。SASH1-siRNA有效抑制MDA-MB-231细胞SASH1蛋白表达(P<0.05),且P-ERK1/2在SASH1抑制组表达增加。结论 MAP2K2和MAP4K4是SASH1的重要的候选结合蛋白,SASH1可能通过与其直接或间接结合串话ERK信号传导通路,进而调节细胞增殖和迁移等细胞生物学功能。

miR-556-3p通过靶基因SASH1调控子宫内膜癌细胞的活力、迁移和侵袭

目的:研究微小RNA-556-3p(miR-556-3p)是否通过靶向SASH1基因调控子宫内膜癌细胞的活力、迁移和侵袭。方法:采用RT-qPCR和Western blot检测miR-556-3p和SASH1的mRNA和蛋白在子宫内膜癌组织中的表达。向子宫内膜癌Ishikawa细胞转染anti-miR-556-3p或pcDNA-SASH1,采用MTT法检测细胞活力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白的表达。StarBase预测和双萤光素酶报告实验分析miR-556-3p和SASH1的靶向关系。将anti-miR-556-3p和si-SASH1共转染Ishikawa细胞,采用上述方法检测其对细胞活力、迁移和侵袭能力的影响。结果:与癌旁组织比较,子宫内膜癌组织中miR-556-3p的表达量显著增加,SASH1的mRNA和蛋白表达量显著减少(P<0.05)。抑制miR-556-3p表达或使SASH1过表达显著降低Ishikawa细胞活力、迁移细胞数、侵袭细胞数,以及cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平,显著提高p21蛋白水平(P<0.05)。miR-556-3p靶向SASH1并负性调控其表达。敲减SASH1的表达逆转了miR-556-3p低表达对Ishikawa细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用。结论:抑制miR-556-3p表达可以抑制子宫内膜癌细胞的活力、迁移和侵袭,作用机制与调控其靶基因SASH1有关。

小细胞肺癌中SASH1蛋白的表达情况及其与E-钙黏蛋白表达的相关性分析

目的探讨小细胞肺癌(SCLC)中SASH1蛋白的表达情况及其影响因素,并进一步分析其与E-钙黏蛋白表达的相关性。方法采用免疫组化方法测定50例SCLC患者的癌及癌旁组织中SASH1蛋白和E-钙黏蛋白的表达情况,分析SCLC癌组织中SASH1蛋白表达的影响因素及SCLC癌组织中SASH1蛋白、E-钙黏蛋白表达的相关性。结果在光学显微镜下观察发现,SASH1蛋白主要在SCLC癌及癌旁组织的细胞质中表达,在部分细胞核中亦可见表达;E-钙黏蛋白主要在SCLC癌及癌旁组织的细胞膜中表达。SCLC癌组织中SASH1蛋白、E-钙黏蛋白的阳性表达率分别为44.00%、48.00%,均低于癌旁组织的74.00%、80.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。SCLC伴有淋巴结转移的SASH1蛋白阳性表达率为34.21%,不伴有淋巴结转移的SASH1蛋白阳性表达率为75.00%,差异有统计学意义(P<0.05);SASH1蛋白在SCLC不同TNM分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)中的阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。经Spearman相关性分析,SCLC癌组织中SASH1蛋白表达水平与E-钙黏蛋白表达水平呈正相关(r=0.519,P<0.05)。结论SASH1蛋白和E-钙黏蛋白在SCLC中的表达下调,且表达呈正相关,两者在SCLC的进展中可能具有协同作用。

SASH1-IQGAP1-E-cadherin信号轴可能调节乳腺癌转移

目的:探讨SASH1(SAM-and SH3-domain containing 1)基因作为一个新的抑癌基因,在调节乳腺癌转移过程中的分子作用机制。方法:免疫组织化学法检测人乳腺癌组织中SASH1、含IQ模序的GTP酶活化蛋白1(IQ motif-containing GTPase activating protein 1,IQGAP1)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平,并分析三者之间的相关性,以及SASH1和IQGAP1表达与乳腺癌患者临床指标的相关性。构建重组质粒HA-IQGAP1-pcDNA3.0和pEGFP-C3-SASH1,并将其转染人胚胎肾细胞HEK-293T,然后采用免疫沉淀-蛋白质印迹法分析SASH1与IQGAP1的相互作用。结果:人乳腺癌组织中,SASH1与IQGAP1的表达存在相关性(P<0.05),而且二者分别与E-cadherin的表达明显相关(P值均<0.001);另外,SASH1和IQGAP1蛋白表达分别与乳腺癌的肿瘤直径和肿瘤分级有相关性(P值均<0.05),但与淋巴结转移无相关性(P值均>0.05)。成功构建重组质粒HA-IQGAP1-pcDNA3.0和pEGFP-C3-SASH1;重组质粒转染HEK-293T细胞后,发现SASH1与IQGAP1之间存在蛋白-蛋白相互作用。结论:SASH1与IQGAP1结合后可发生蛋白-蛋白相互作用,并且与E-cadherin的表达密切相关。推测SASH1可能与IQGAP1和E-cadherin形成一条新的调节乳腺癌转移的信号轴。

SASH1基因通过p53信号通路调节乳腺癌细胞增殖

目的探讨SASH1基因对乳腺癌细胞增殖的作用及其与p53基因的关系。方法购买134例乳腺癌组织芯片(上海芯超科技有限公司,芯片型号:HBre-Duc150Sur-01),用SASH1和p53抗体进行组织芯片免疫组织化学染色分析。构建重组质粒SASH1-PEGFP-C3(GFP-SASH1)、HA-p53-pcD NA3.0(HA-Tp53),定点突变SASH1基因上581、594、605、610位点(D581V-SASH1、W594L-SASH1、F605S-SASH1、V610E-SASH1)和p53基因上175、248、273位点(R175H-p53、R248W-p53、R273H-p53)。实验分组如下:(1)将0、0.5、1.0、2.0、4.0μg的HA-Tp53单独转染或分别与2.0μg的GFP-SASH1共同转染至HEK-293T细胞,用Western blot检测p53对GFP-SASH1和endo-SASH1表达的影响。(2)将0、0.5、1.0、2.0、4.0μg的GFP-SASH1单独转染或分别与2.0μg的HA-Tp53共同转染至HEK-293T细胞,用定量RT-PCR检测p53 mRNA及蛋白表达。(3)2.0μg的HA-pcD NA3.0(空载体),野生型p53(wt-p53),突变型R175H-p53、R248W-p53、R273H-p53单独转染或分别与2.0μg的GFP-SASH1共同转染至HEK-293T细胞,用Western blot检测GFP-SASH1和endo-SASH1表达。(4)将2.0μg的空载体,野生型-SASH1,突变型D581V-SASH1、W594L-SASH1、F605S-SASH1、V610E-SASH1单独转染或与2.0μg的HA-Tp53共同转染HEK-293T细胞,另设未经处理细胞为空白对照,Western blot检测HA-Tp53和endo-Tp53表达。用Spearman相关系数法对SASH1与p53免疫组织化学结果进行分析,用单因素方差分析方法比较SASH1与p53的表达量,两两比较采用LSD-t法。结果在134例人乳腺癌组织芯片中,SASH1和p53的表达呈正相关(r=0.319,P<0.001)。其中,SASH1(-)4例、(+)42例、(++)67例、(+++)20例、(++++)1例,p53(-)82例、(+)36例、(++)10例、(+++)6例。随着HA-Tp53转染剂量的增大,外源性SASH1(GFP-SASH1)和内源性SASH1(endo-SASH1)的表达水平都增高(F=205.369、178.238,P均<0.001)。随着GFP-SASH1转染剂量的逐渐增大,HA-Tp53 mRNA及蛋白表达量逐渐增加(F=67.481、506.538,P均<0.001)。突变型SASH1使内源性和外源性p53表达上调(F=165.767、1136.930,P均<0.001);突变型p53抑制内源性和外源性SASH1表达(F=57.142、354.517,P均<0.001)。结论 SASH1与p53正相关,对乳腺癌细胞增殖起调节作用。