SB-431542抑制转化生长因子β1诱导的人胚肺成纤维细胞(HLF)细胞外基质的合成

目的研究转化生长因子β1(TGFβ1)的特异性小分子拮抗剂SB 431542在TGFβ1信号系统功能增强的状况下,对人胚肺成纤维细胞(HLF)合成细胞外基质的影响。方法人胚肺成纤维细胞系(HLF)于体外正常培养。用MTT法评价SB 431542对HLF的细胞毒作用;以半定量RTPCR(reverse transcription polymerase chain reaction)法和琼脂糖凝胶电泳法观察细胞外基质(ECM)中主要组成分子I型胶原α1(Col Iα1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI 1)和纤维粘连素(FN)的变化。结果SB 431542对HLF的LC50(50%lethal concentration)为52μmol.L-1;在TGFβ1(10μg.L-1)诱导下,SB 431542(0.1、0.5、1.0、10μmol.L-1)可剂量依赖性抑制Col Iα1、PAI 1和FN的mRNA在HLF细胞内的转录。结论SB 431542可明显抑制由于肺内TGFβ1信号系统增强而引起的ECM的合成,表明作用于TGFβ1途径的SB 431542或其他小分子化合物可能对防治肺纤维化有效。

瘦素与SB-431542干预大鼠肝星状细胞及其生物学活性的改变

目的研究TGF-β1受体特异性拮抗剂SB-431542干预瘦素对肝星状细胞的生物活性及其相关机制。方法采用RT-PCR法检测α1(I)前胶原mRNA和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的变化;用间接免疫荧光来观察α1(I)前胶原蛋白、α-SMA蛋白的表达。结果瘦素加SB-431542组与瘦素组相比,各指标之间的差异有统计学意义(P<0.05),随浓度的增加,时间的延长,SB-431542对瘦素刺激的HSC-T6增殖纤维化有显著的抑制作用。结论 SB-431542可明显抑制瘦素的生物学活性,可能通过抑制TGF-β1信号系统而使细胞外基质(ECM)的合成减少,从而抑制肝纤维化。

TGF-β抑制剂SB-431542对支气管哮喘小鼠气道重塑的干预作用

目前认为气道重塑是除气道慢性炎性反应之外哮喘的另一个重要特征。气道重塑不仅导致不可逆性的气流阻塞而增加气道阻力﹑加重气道高反应性,进而导致严重的肺功能低下。目前治疗和预防哮喘的有效药物是糖皮质激素,它虽然能抑制炎性反应、减轻症状,但不能逆转已形成的气道结构改变,

SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响

通过研究转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的特异性小分子拮抗剂SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响,探讨转化生长因子β在鹿茸快速生长中的调节机制。分离培养生长30天的梅花鹿鹿茸软骨层细胞,将传代培养第2代的细胞经不同浓度的SB-431542(0、1、3、5、8、10μmol/L)作用,培养48h后用MTT法测其细胞增殖的变化,并用SPSS软件分析其差异性。结果显示,SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对照组(P<0.05),其中浓度为8μmol/L和10μmol/L的SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著(P<0.01),随着添加SB-431542浓度的升高,对细胞的生长速度抑制更加明显,试验结果表明,TGF-β对维持梅花鹿鹿茸软骨层细胞的快速增殖有重要作用。

梅花鹿鹿茸间充质层与前成软骨层细胞的培养及SB-431542对其增殖的影响

分离培养梅花鹿鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞,通过研究TGF-β的特异性小分子拮抗剂SB-431542对这两种细胞增殖的影响,探讨TGF-β在鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞增殖与分化中的调节机制。从生长30天的梅花鹿鹿茸中分离间充质层细胞和前成软骨层细胞,进行体外培养,将传代培养第2代的间充质层细胞和前成软骨层细胞分别在含不同浓度TGF-βⅠ型受体特异性抑制剂SB-431542(0、1、3、5、8、10μmol/L)的培养液中培养,48h后用MTT法测定这两种细胞增殖活性的变化,用SPSS软件对其增殖的差异性进行分析。结果显示,体外培养的鹿茸间充质层细胞呈成纤维细胞样,前成软骨层细胞呈纺锤形或梭形,台盼兰染色显示细胞活性均在90%以上。经SB-431542处理的间充质层细胞的增殖活性低于对照组(P<0.05),而前成软骨层细胞增殖活性高于对照组(P<0.05),且3μmol/L和5μmol/L的SB-431542处理的前成软骨层细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.01)。试验表明,TGF-β可能在维持鹿茸间充质层细胞的快速增殖和诱导间充质细胞向软骨细胞分化等过程中起重要的作用。

CoCl2诱导黑素瘤A375细胞上皮间质转化、糖酵解及SB-431542干预研究

目的探讨CoCl 2刺激的黑素瘤A375细胞上皮间质转化和糖酵解的作用机制及SB-431542对此的干预作用。方法选用本团队前期已证实的安全有效浓度的CoCl 2(50~150μmol/L)刺激黑素瘤A375细胞,建立体外低氧模型,Western Blot检测HIF-1α、Nodal、上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin、MMP2及糖酵解各组分蛋白LDH-A、LDH-B的表达,以明确CoCl 2对A375细胞上皮间质转化和糖酵解的影响作用。随后研究SB-431542对Nodal-ALK4-ALK7介导A375细胞上皮间质转化和糖酵解反应的抑制作用:本部分拟筛选安全有效浓度的Nodal受体抑制剂(SB-431542)分别作用于CoCl 2介导的低氧模型,通过MTT实验确定SB-431542的安全浓度用于后续实验。Western blot检测SB-431542对CoCl 2诱导细胞上皮间质转化和LDH活化相关蛋白的影响;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱的变化情况;此外,使用Western blot检测Nodal及其受体(ALK4、ALK7)的表达。结果CoCl 2可显著上调细胞上皮间质转化相关蛋白Vimentin、MMP2和促瘤相关蛋白Nodal及其受体(ALK4、ALK7)的表达,且表达与作用浓度成正相关;CoCl 2能促进糖酵解活化相关蛋白表达,其中LDH-A表达上调,LDH-B的表达受到抑制(P<0.05)。MTT结果显示10μmol/L SB-431542处理48 h对细胞的增殖影响最小(P<0.05);SB-431542可抑制Vimentin、MMP2和Nodal及其受体ALK4、ALK7表达(P<0.05);促进糖酵解途径的相关蛋白LDH-A的表达下调(P<0.05),抑制糖酵解途径相关蛋白LDH-B的表达上调(P<0.05)。结论CoCl 2可诱导黑素瘤细胞上皮间质转化及糖酵解。SB-431542可通过抑制CoCl 2诱导的Nodal-ALK4-ALK7信号通路抑制与上皮间质转化及糖酵解相关分子的表达。

SB-431542抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖和侵袭及其机理研究

肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因，TGF-β超家族成员Nodal分子被证实参与肿瘤细胞的增殖和转移，因而基于Nodal信号为靶标开展抗肿瘤研究成为可能。该研究应用Western blot检测乳腺癌细胞株BT-549、T-47D、MCF-7、SK-BR-3和MDA—MB-231中的Nodal和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达水平，发现它们在BT-549细胞中表达量最高。然后采用不同浓度_Nodal信号抑制剂SB．431542（1-50μmol／L）处理BT-549细胞48h，利用MTT法揭示20～50gmol／L的SB-431542抑制该细胞增殖。进一步利用细胞划痕和Transwell实验证明，10μmol／L的SB-431542可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。最后，通过明胶酶谱和Westernblot显示，10～30gmol／L的sB．431542可剂量依赖性地抑制MMP-2的表达和活性。上述结果说明，SB-431542通过阻断Nodal信号通路可效抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与降低MMP-2的表达和活性有关。

SB-431542对树突状细胞融合疫苗的制备和抗小鼠胰腺癌效应的影响

目的研究SB-431542对树突状细胞（DC）融合疫苗的制备和抗小鼠胰腺癌效应的影响。方法（1）SB-431542（转化生长因子-β1受体阻滞剂）与粒细胞集落刺激因子、白细胞介素4、脂多糖联合应用，刺激C57BL／6小鼠骨髓来源DC成熟，应用聚乙二醇融合技术融合DC和小鼠胰腺癌细胞，制备融合疫苗。②观察细胞形态、细胞表面表达、MTT比色法检测检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。③制备荷瘤胰腺癌小鼠模型，分三组分别观察肿瘤体积大小，生存期观察。结果①在SB-431542参与下，成熟DC的细胞数目及形态无显著改变。②DC表面CD80、CD86、CD40的表达较未加SB-431542显著增高；MTT比色法，添加SB-431542的DC疫苗组对肿瘤细胞的杀伤抑制率显著提高。③体内抗肿瘤效应SB-431542的DC疫苗组肿瘤大小明显减小．生存期显著提高（P〈0．05）。结论SB-431542组融合细胞的分子表达较非SB-431542组显著提高，体外体内均显示SB-431542组有更好的抗肿瘤效应，说明SB-431542对增强融合疫苗抗胰腺癌特异性免疫效应有明显的作用。

Notch通路对乙醛激活大鼠肝星状细胞株的增殖及转分化的影响

目的观察Notch通路对乙醛激活大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖并转分化为肌成纤维细胞的影响。方法 HSC-T6细胞常规培养及乙醛处理,加入Notch途径特异性阻断剂DAPT和TGF-β/ALK5途径特异性阻断剂SB-431542,分为空白组、单阻断组及双阻断组;MTT法检测细胞增殖;ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白(TIMPⅠ)、纤维黏连素(FN)的表达;RT-PCR检测Notch途径节点分子RBP-JK、Hes1及效应蛋白Smad3表达量;Western印迹检测细胞内效应蛋白α-SMA的表达。结果 MTT检测发现乙醛刺激明显增强HSC活性(P<0.05),阻断组明显下调(P<0.05);ELISA结果表明乙醛刺激后TIMP I和FN的表达明显上调(P<0.05),阻断组明显下调(P<0.05);RT-PCR检测Hes1乙醛刺激后上调明显(P<0.05),阻断组RBP-JK、Hes1及Smad3明显下调(P<0.05),双阻断组Hes1及Smad3下调更明显(P<0.05);Western印迹检测结果显示乙醛刺激明显促进α-SMA表达(P<0.05),阻断组明显下调(P<0.05),双阻断组下调更明显(P<0.05)。结论 Notch通路明显影响乙醛对肝星状细胞的增殖及转分化为肌成纤维细胞。

TGF-β_1受体阻滞剂对树突状细胞融合疫苗制备的影响研究

目的探讨TGF-β1受体阻滞剂SB-431542对树突状细胞(DC)融合疫苗制备的影响。方法①SB-431542(TGF-β1受体阻滞剂)与粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)联合应用,刺激C57BL/6小鼠骨髓来源DC成熟,应用聚乙二醇(PEG)融合技术融合DC和小鼠胰腺癌细胞(Panc02),制备融合疫苗。②观察细胞形态、细胞表面表达、MTT法检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。结果①在SB-431542参与下,成熟DC的细胞数目及形态无显著改变;②DC表面CD80、CD86、CD40的表达较未加SB-431542显著增高;MTT比色法,添加SB-431542的DC疫苗组对肿瘤细胞的杀伤抑制率显著提高。结论 SB-431542组融合细胞的分子表达较非SB-431542组显著提高;体外MTT显示SB-431542组有更好的抗肿瘤效应,说明SB-431542对增强融合疫苗抗肿瘤效应有明显的增强作用。

4-[4-(3,4-亚甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺的合成工艺改进

目的改进4 - [4 -(3,4 亚甲二氧基苯基) - 5 (2 - 吡啶基) 1H 咪唑- 2 - 基]苯甲酰胺(SB -4 315 4 2 )的合成工艺。方法关键中间体4 -[4- (3,4 - 亚甲二氧基苯基) - 5 -(2 - 吡啶基) - N 1 -羟基咪唑 -2 -基]苯腈(1)以三氯化肽[Ti(Ⅲ)Cl3 ]还原得到4 -[4 - (3,4 亚甲二氧基苯基) - 5 - (2 -吡啶基) - 1H 咪唑- 2 - 基]苯腈(2 ) ;2在叔丁醇中以氢氧化钾水解将腈基转化为胺酰基得到了SB -4 315 4 2。结果与讨论中间体和终产物经1H- NMR和MS鉴定,均与文献的数据相符。该合成工艺缩短了合成路线、简化了操作、提高了收率和纯度,避免了使用毒性大的亚磷酸三乙酯[P(OEt) 3 ]。

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1(TGF-β1)致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞向成纤维细胞转化的影响,及活化素受体样激酶5(activated receptor kinase 5,ALK5)抑制剂(SB-431542)对这一影响的干预作用。方法体外培养人RPE细胞,随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理,其余三组分别用10μg·L-1 TGF-β1、10μg·L-1 TGF-β1+30μmol·L-1 SB-431542、30μmol·L-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率;划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况;免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达;Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)以及纤维粘连素(fibronectin,FN)蛋白的表达。结果与对照组相比,TGF-β1作用于RPE细胞24 h后,可改变RPE细胞表型,使其呈成纤维细胞样外观,并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的(1.33±0.08)倍,30μmol·L-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L-1 TGF-β1处理组的(67.77±6.78)%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调,分别是对照组的(3.69±0.37)倍、(1.76±0.05)倍、(2.58±0.18)倍、(1.86±0.11)倍、(1.74±0.08)倍;SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调,分别是TGF-β1处理组的(67.73±5.15)%、(71.71±3.50)%、(79.87±0.05)%、(63.59±3.16)%、(83.07±2.31)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移,向成纤维细胞转化,并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达;SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。

转化生长因子β_1Ⅰ型受体拮抗剂对支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)Ⅰ型受体拮抗剂SB431542对慢性支气管哮喘(简称哮喘)小鼠模型气道炎症及气道重塑的影响,为哮喘的治疗提供新思路。方法将40只BALB/c小鼠随机分为正常组、哮喘组、布地奈德组及SB431542组,每组10只;卵清蛋白(OVA)致敏、激发建立慢性哮喘小鼠模型;布地奈德组和SB431542组分别给予布地奈德雾化吸入和SB431542滴鼻,每周3次。HE和Masson染色观察各组小鼠气道炎症及胶原沉积情况;AB-PAS染色观察杯状细胞增生情况;免疫组织化学半定量法测定气道壁α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中IL-4、IL-5、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1水平及血清总IgE水平;免疫印迹法(Western blot)测定各组小鼠肺组织中Smad3、p-Smad3及Smad7蛋白表达。结果哮喘组与正常组相比,嗜酸粒细胞浸润增多,气道管腔狭窄,平滑肌层增厚,胶原纤维增生;布地奈德组上述改变均较哮喘组轻;SB431542组嗜酸粒细胞浸润较哮喘组减轻,但仍高于正常组及布地奈德组,平滑肌层增厚、胶原纤维增生较哮喘组明显减轻(P<0.05),与布地奈德组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,哮喘组小鼠支气管AB-PAS及α-SMA阳性染色面积/支气管基底膜周径显著增加(P<0.05),布地奈德组及SB431542组小鼠支气管AB-PAS及α-SMA阳性染色面积/支气管基底膜周径低于哮喘组(P<0.05)。哮喘组气道炎症指标(血清总IgE、IL-4、IL-5及TGF-β1)显著高于正常组(P<0.05),布地奈德组上述指标低于哮喘组(P<0.05),SB431542组与哮喘组比较差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-9、TIMP-1在哮喘组的表达明显高于正常组(P<0.05),在布地奈德组及SB43542组的表达低于哮喘组(P<0.05),两治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Westernblot检测显示,各组小鼠肺组织Smad3的表达差异无统计学意义(P>0.05);哮喘组p-Smad3表达明显高于正常组(P<0.05),布地奈德组及SB431542组p-Smad3表达低于哮喘组(P<0.05);与正常组比较,哮喘组Smad7表达降低(P<0.05),布地奈德组及SB431542组Smad7表达高于哮喘组(P<0.05),且这两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SB431542能显著减轻哮喘小鼠细胞外基质沉积及平滑肌增厚,延缓哮喘小鼠气道重塑进程,该作用可能部分与其调节MMP-9、TIMP-1的表达有关。SB431542对哮喘小鼠气道炎症浸润无明显改善,说明哮喘气道炎症可能不依赖于TGF-β1/Smads通路。

转化生长因子β1I型受体拮抗剂对支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响

目的研究转化生长因子β1（TGF-β1）I型受体拮抗剂SB431542对慢性支气管哮喘（简称哮喘）小鼠模型气道炎症及气道重塑的影响，为哮喘的治疗提供新思路。方法将40只BALB／c小鼠随机分为正常组、哮喘组、布地奈德组及SB431542组，每组10只；卵清蛋白（OVA）致敏、激发建立慢性哮喘小鼠模型；布地奈德组和SB431542组分别给予布地奈德雾化吸入和SB431542滴鼻，每周3次。HE和Masson染色观察各组小鼠气道炎症及胶原沉积情况；AD-PAS染色观察杯状细胞增生情况；免疫组织化学半定量法测定气道壁a-平滑肌肌动蛋白（a—SMA）的表达；酶联免疫吸附试验（ELIsA）法检测BALF中IL-4、IL-5、TGF-81、MMP-9、TIMP-1水平及血清总IgE水平；免疫印迹法（Westernblot）测定各组小鼠肺组织中Smad3、p-Smad3及Smad7蛋白表达。结果哮喘组与正常组相比，嗜酸粒细胞浸润增多，气道管腔狭窄，平滑肌层增厚，胶原纤维增生；布地奈德组上述改变均较哮喘组轻；SB431542组嗜酸粒细胞浸润较哮喘组减轻，但仍高于正常组及布地奈德组，平滑肌层增厚、胶原纤维增生较哮喘组明显减轻（P〈0．05），与布地奈德组比较差异无统计学意义（P〉o．05）。与正常组比较，哮喘组小鼠支气管AB-PAS及a-SMA阳性染色面积／支气管基底膜周径显著增加（P〈0．05），布地奈德组及SB431542组小鼠支气管AB-PAS及a—SMA阳性染色面积／支气管基底膜周径低于哮喘组（P〈O．05）。哮喘组气道炎症指标（血清总IgE、IL-4、IL-5及TGF-β1）显著高于正常组（Pd0．05），布地奈德组上述指标低于哮喘组（P〈0．05），SB431542组与哮喘组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。MMP-9、TIMP-1在哮喘组的表达明显高于正常组（P〈0．05），在布地奈德组及SB43542组的表达低于哮喘组（P〈O．05），两治疗组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。Westernblot检测显示，各组小鼠肺组织Smad3的表达差异无统计学意义（P〉O．05）；哮喘组p-Smad3表达明显高于正常组（P〈0．05），布地奈德组及SB431542组p-Smad3表达低于哮喘组（P〈O．05）；与正常组比较，哮喘组Smad7表达降低（P〈0．05），布地奈德组及SB431542组Smad7表达高于哮喘组（P〈0．05），且这两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论SB431542能显著减轻哮喘小鼠细胞外基质沉积及平滑肌增厚，延缓哮喘小鼠气道重塑进程，该作用可能部分与其调节MMP-9、TIMP-1的表达有关。SB431542对哮喘小鼠气道炎症浸润无明显改善，说明哮喘气道炎症可能不依赖于TGF-β1／Smads通路。