农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。

玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究

应用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对。结果表明:克隆片段长度为562 bp。将该基因反向插入到pWGLL载体Actin-pro启动子下游,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系"铁7922",经PCR检测初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。

玉米sbe2a基因RNAi载体的构建及转化玉米的初步研究

采用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列分析。结果表明:克隆片段长度为562 bp,将该基因的正义和反义片段插入到pCAMBIA1301改造过的载体p35-1301的35S启动子下游,构建高效RNAi表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系"铁7922",经过PCR检测获得了4株转基因株系,初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料

【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。

小麦籽粒胚乳中淀粉分支酶基因的RNAi表达载体的构建及表达

构建sbe2b的RNAi表达载体,并对其转化烟草,检测其对直链淀粉合成的影响。利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定小麦胚乳淀粉分支酶sbe2b的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从小麦籽粒胚乳中成功克隆出了小麦胚乳中淀粉分支酶sbe2b基因的部分序列(300 bp)(GenBank No.AY740401),以植物表达载体PZP35S为基础,构建了由组成型启动子35S调控的sbe2b基因的RNAi植物表达载体。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在转基因烟草中的相对表达量,并测定转基因植株中直链淀粉的含量和支链淀粉含量的变化。结果表明:经qRT-PCR证实sbe2b基因的表达量较对照下降,而且支链淀粉含量变化显著,直链淀粉较对照有上升但变化没有达到显著水平。

大麦转玉米淀粉分支酶基因的初步研究

以5个大麦品种的由成熟胚再生体系产生的胚性愈伤组织为受体材料,以构建好的Bar基因为选择基因的玉米淀粉分支酶基因表达载体为目的基因,用基因枪法对其进行了转化.在转化的大麦中,5个不同基因型品种的抗性愈伤获得率为10.32 %～17.13 %,将抗性愈伤组织转移到分化培养基中进行分化,绿苗分化率为0 %～14.29 %,移栽到小花盆中的再生植株有28株.其中87-3175有11株,87-0053有9株,97-4010有3株,97-6004未分化出苗,208813-509有5株;移栽成活的87-3175有4株,87-0053有5株,208813-509有3株.对10株再生植株进行了PCR检测,其中有7株扩增出0.5kb的Bar基因特异条带,2株扩增出2.4 kb的sbe2b基因特异条带,3株扩增出2.5 kb的sbe1基因特异条带.对PCR扩增的条带回收测序,测序结果与各自的基因序列相符合,说明外源基因已经整合到大麦基因组中.

下丘脑Sonic hedgehog阳性细胞谱系追踪分析

为了揭示下丘脑Sonic hedgehog(Shh)阳性细胞及其子代细胞的发育去向,利用特异性的增强子SBE2(Shh brain enhancer-2,SBE2),构建了SBE2-Cre转基因小鼠,并结合Rosa26-m TmG和Rosa26-LacZ报告基因小鼠,对SBE2+细胞进行了谱系追踪研究.结果显示,小鼠胚胎期E10.5,SBE2+细胞开始出现在视前区(preoptic area),然后沿下丘脑前侧区到下丘脑后侧区形成条带,覆盖了腹侧间脑大部分区域;胚胎期E12.5,SBE2+细胞主要出现在视囊,前侧下丘脑,腹侧下丘脑上皮细胞,乳头体外侧核,乳头状核,外侧下丘脑,在腹侧下丘脑有着较强的表达.胚胎期E16.5和出生后第10 d,SBE2在下丘脑大部分区域表达.对比内源性Shh表达,SBE2+细胞特异性的代表下丘脑Shh+细胞,是分化形成下丘脑神经核的主要细胞来源,而SBE2-Cre小鼠可作为研究基因在下丘脑区域功能的重要工具鼠.