基于SCAR分子标记和倍性鉴定兰属花卉的研究

基于特异性片段扩增(SCAR)和倍性鉴定兰属花卉,为杂交育种亲本选配奠定基础,以兰属花卉的27个大花蕙兰和31个国兰品种为试材,通过SCAR分子标记和流式细胞仪进行亲缘关系和倍性检测,构建系统进化树。SCAR分子标记构建的系统进化树结果显示:58个品种聚为3支,第1支包括8个大花蕙兰品种(福娘、523、红袍等)和16个国兰品种(碧龙红素、汗血宝马、出水芙蓉等),第2支为11个大花蕙兰品种(金玉满堂、日本香兰、红双喜等)和6个国兰品种(一代天骄、春兰麻壳素、如意素荷等),第3支包括8个大花蕙兰品种(616、黄金岁月、杨贵妃等)和9个国兰品种(碧龙奇莲、西蜀道光、大雪素等);倍性鉴定结果显示:27个大花蕙兰品种中有7个二倍体(日本樱花、绿翡翠、梦境等)、16个三倍体(黄金岁月、蝶影、日本香兰等)、4个四倍体(英雄、523、福娘等)。部分大花蕙兰和国兰品种亲缘关系较近,可用作杂交育种亲本,但由于大花蕙兰倍性较为丰富。因此,大花蕙兰作为杂交育种亲本,选配时需进行倍性鉴定。综上,SCAR分子标记能高效、全面和精准鉴别兰属花卉间的亲缘关系,结合倍性鉴定,可为高效杂交育种奠定基础。

阿拉尔棉田烟粉虱捕食性天敌的SCAR分子标记检测

为了明确阿拉尔垦区棉田烟粉虱种群隐种以及烟粉虱捕食性天敌种类,采集阿拉尔十二团棉田中的烟粉虱及烟粉虱捕食性天敌,利用B-F/B-R、Q-F/Q-R特异性引物检测烟粉虱隐种类型,利用烟粉虱TB-F94585/TB-R 94585特异性引物检测捕食性天敌肠道内是否存在烟粉虱DNA。结果表明:新疆阿拉尔垦区烟粉虱为MED隐种,初步发现烟粉虱的捕食天敌共有4目5科,包括多异瓢虫成虫、多异瓢虫幼虫、东亚小花蝽、中华草蛉幼虫、黄褐新园蛛、灌木新园蛛、直伸肖蛸。利用SCAR分子标记技术可以快速检测阿拉尔垦区烟粉虱捕食性天敌种类。

苹果柱型基因Co的一个AFLP标记的SCAR转换

将苹果柱型基因的一个AFLP标记成功地转换成了简单实用的SCAR标记。首先对AFLP标记片段进行序列测定 ,然后根据序列特点设计了两对特异引物CoA1/CoA2 和CoA1/CoA3 ,每条引物长 2 0bp。PCR结果表明CoA1/CoA2 可以扩增出 2 16bp和 148bp两条带 ,其中 2 16bp的为柱型性状的特征带 ;CoA1/CoA3 可以扩增出 2 73bp和 2 0 5bp的两条带 ,其中 2 73bp的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低 (CoA1/CoA2 为 6 .3%± 2 .5 % ;CoA1/CoA3 为 7.3%±2 .6 % ) ,所以它们都可以作为该SCAR标记的特异引物所用。

玉米对生性状两个显性基因SCAR分子标记

把与玉米对生叶突变体对生性状两个显性位点紧密连锁的RAPD标记S312 3 77与S36 0 60 2 成功地转化成SCAR标记CBJ1与CBJ2。对RAPD片段的纯化、T A克隆、SCARPCR引物的设计等SCAR标记转化进行了探讨 ,并对CBJ1与CBJ2进行了验证 ,为对生玉米的分子标记辅助选择与定位克隆奠定了基础。

偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立

用 10 0条 10碱基随机引物 ,以普通小麦中国春、中间偃麦草为材料进行 RAPD分析 ,筛选到一个偃麦草染色体组特异引物 OPF0 3,并从中间偃麦草中克隆了该引物的特异 DNA片段 OPF0 312 91。将该片断与比萨偃麦草中的 OPF0 312 96(Gen Bank序号 U4 35 16 )比较 ,同源性为 88%。根据 OPF0 312 91的序列 ,设计了 2对SCAR引物 ,利用 OPF0 3和引物 P3、P4对普通小麦、普通小麦 -中间偃麦草的部分双二倍体、长穗偃麦草、中间偃麦草、小麦 -二倍体长穗偃麦草代换系、附加系共 6类材料进行了 RAPD和 SCAR分析 ,发现 RAPD标记OPF0 312 91没有出现在含 Ee染色体组的材料中 ,而标记 SCAR982 则出现于所有含 E染色体组的材料中。说明 ,根据 Eb 染色体组特异 RAPD标记转化的 SCAR标记 ,可以同时检测小麦背景下的 Ee

香蕉枯萎病菌生理小种鉴定及其SCAR标记

通过室内人工接种蕉类鉴别寄主,对采集于广东蕉区的18个蕉类枯萎病菌菌株进行鉴定,KP021、KP022、GZ981和 JL021 4个菌株属Race 1,其余14个菌株属Race 4,说明广东蕉区同时存在尖孢镰刀菌古巴专化型Race 1和Race 4。用 RAPD技术对上述18个菌株进行分析,从200条随机引物中筛选出8条引物可产生生理小种RAPD标记12个,其中标记 Race 1的8个,标记Race 4的4个。对这些RAPD标记带分别进行回收、克隆、测序,根据这些特异片段序列分别设计相应的SCAR引物,通过对18个菌株的PCR扩增检验,有4个RAPD标记成功地转化为SCAR标记,其中Race 1-SCAR标记1 个、Race 4-SCAR标记2个、同时能鉴定出2个小种的SCAR标记1个。应用这4个SCAR标记同时对采自田间的9个病菌分离物进行检测,能够准确地鉴定出广东蕉区的尖孢镰刀菌古巴专化型Race 1和Race 4,这为下一步开展香蕉枯萎病菌生理小种的分子鉴定及各生理小种田问流行动态监测奠定了基础。

黄瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR标记

以感霜霉病黄瓜L18-10-2和抗霜霉病黄瓜129为亲本构建F2代分离群体,以F3代植株霜霉病抗性鉴定表示F2代各单株抗病性并得以区分各单株杂合或纯合感病性,采用RAPD技术和转SCAR的方法筛选黄瓜抗霜霉病基因分子标记.结果显示,在318条RAPD引物中有18条引物表现出两亲本间多态性,其中引物P18的SB-SP18561扩增片段与霜霉病抗病基因之间紧密连锁,根据交换率和Kosambi函数公式计算其遗传距离为7.85 cM.回收SBSP18561片段并克隆和测序,其准确长度为561 bp.将该RAPD标记转换为SCAR标记,长度为494 bp,命名为SSBSP18494.

松材线虫SCAR标记与检测技术

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。

与苹果Co基因紧密连锁的RAPD标记的筛选及其SCAR标记转换(英文)

以短枝富士 (SpurFuji)×舞姿 (Telamon)的 10 5株F1群体为试材 ,利用RAPD技术 ,结合集群分类分析法(BSA)进行了苹果柱型基因 (Co)分子标记的研究。通过对 30 0条随机引物的筛选 ,获得一个与Co基因紧密连锁的RAPD标记S114 2 682 ,连锁距离为 2 .86cM。对该标记片段进行序列测定 ,然后根据序列特点设计了 4条特异引物(其中正向引物与反向引物各两条 )。PCR结果显示 ,这 4条引物的 4种组合都可以扩增出柱型性状的特征带。选其中之一进行群体上的分析 ,结果表明该SCAR标记特征带与柱型性状的共分离行为与原RAPD标记表现一致。可见 ,此组合的引物可以作为该SCAR标记的特异引物。通过对S114 2 682 标记片段序列分析发现 ,在 +45～ +2 5 1区域含有一个可编码 6 8个氨基酸残基的ORF。

草鱼种质相关SRAP及SCAR的分子标记

采用相关序列扩增多态性(Sequence-realted Amplified Polymorphism,SRAP)技术分析野生草鱼和家养草鱼,筛选与草鱼种质退化相关的分子遗传标记。共进行88对引物组合的检测,产生标记数目共计905个。依据标记在群体中出现的频率和变化规律,共筛选出21个可能与种质相关的特异性标记,对这些特异性标记进行测序并将测序结果进行BLAST分析。发现测得片段中有8个片段在GenBank中找到同源性较高的序列,而其他片段与数据库中序列的相似性较低。根据序列信息分别设计了3对引物。用这3对引物分别对草鱼三个群体进行PCR扩增,分别产生了SCAR1(308bp)、SCAR2(66bp)、SCAR3(114bp)3个扩增带。采用大样本对这3个标记进行验证,发现其中SCAR1在家养群体中呈现阳性,在野生群体中为阴性,可区分出这两种群体。以SCAR3为引物在174条家养群体中得到目的片段,在26个家养群体没有扩增出条带,分布频率为87%;在100个野生群体中有6个个体检测到该条带,分布频率为6%。以SCAR2为引物在野生群体中完全扩增出目的条带,淡水中心群体中有7条扩增到条带,前洲群体中没有扩增出条带,标记在家养种群中的分布频率为96.50%。因此SCAR1可作为草鱼家养群体的一个重要的分子遗传特征指标,为进一步进行分子标记辅助育种奠定了基础。

一个与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik^m连锁的SCAR标记的分离

本研究将以前在稻瘟病菌菌株S1522获得的与决定对水稻品种梅雨明无毒性的基因(AVR-Pik^m)相连锁的1个RAPD标记OPO12_(1000)进行了克隆和鉴定。核苷酸序列测定与分析结果表明:OPO12_(1000)的大小为946个碱基,不含有与已报道的稻瘟病菌Mg-SINE、Fosburry、Magyy、Grasshopper、Pot2以及Pot3等同源的重复序列。根据OPO12_(1000)的核苷酸序列,设计了1对24个核苷酸的特异引物,对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159、无毒表型群体基因池、毒性表型基因池以及有性杂交后代108个菌株进行了PCR扩增,所有无毒表型的菌株均能特异性地扩增出1条与OPO12_(1000)大小相同的DNA条带,而毒性表型的菌株除5个重组个体外,均不能扩增出这条特异带。此结果表明,与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik^m连锁的RAPD标记OPO12_(1000)被成功地转化为SCAR标记,为进一步通过染色体步移克隆该无毒基因奠定了基础。

玉米自交系8112特异SCAR标记的获得

通过对３个玉米骨干自交系特异ＲＡＰＤ标记的克隆、测序、合成特异引物及ＳＣＡＲ－ＰＣＲ反应条件优化，成功地把其中一个自交系８１１２的特异ＲＡＰＤ标记（０．９ｋｂ）转换成了稳定的ＳＣＡＲ标记。

SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定香菇菌株的有效方法,本研究首先通过对生产上常用的14个香菇菌株进行RAPD多态性分析,从香菇菌株162中扩增获得了一个片段长为1166bp的特异RAPD标记XG1166,随之利用分子克隆技术将该特异RAPD标记成功转化为稳定的SCAR标记。用同样的方法,本研究又从另一香菇菌株申香10号中获得了一段长度为347bp的特异SCAR标记SX347。试验结果表明,利用本研究获得的香菇菌株162和申香10号的特异SCAR标记,能在一天时间内准确鉴定出香菇菌株162或申香10号菌株的真伪。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定香菇菌株的新方法, 可应用于食用菌种质资源保护利用、品种分类与鉴定和假种辨别。

茶树的RAPD标记向SCAR标记转化的研究

SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的一种新型分子标记技术,相对其他分子标记,它具有开发成本低,稳定性高,单位点多态等特点,将为茶树分子育种开辟一条新的有效途径。通过将随机引物在不同茶树品种基因组DNA中扩增得到的特异性片段,经回收、克隆、测序后重新设计1对特异性引物,将RAPD标记成功转化成SCAR标记,提高了分子鉴定的稳定性。

SCAR标记转化失败的原因和对策

SCAR标记作为一种快速、简便可以直接应用的分子标记,在标记辅助选择育种中发挥着重要的作用。但是目前SCAR标记的转化效率不是很高。本文从引物设计、序列相似或多拷贝及DNA甲基化等方面分析SCAR标记转化失败的可能原因;同时从引物设计技巧、PCR反应条件、借助CAPS和SSCP技术以及借助原始标记邻近序列等方面综述了SCAR标记转化失败的情况下获得序列特异性标记的几种有效补救手段。

SCAR标记技术鉴别榆黄蘑品种

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定榆黄蘑菌株的有效方法,本研究通过对生产上常用的16个榆黄蘑菌株进行SRAP多态性分析,从榆黄蘑2号菌株中扩增获得了一个片段长为537bp的特异片段,将其克隆、测序并设计引物,成功转化为稳定的SCAR标记。试验结果表明,利用该特异SCAR标记,能在1d时间内准确鉴定出榆黄蘑2号菌株。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定榆黄蘑菌株的新方法。

与茄子果皮颜色相关联的AFLP及SCAR标记

【目的】寻找与茄子皮色或果皮花青素合成相关基因连锁的分子标记,检验混合品系法(bulked lines analysis)在筛选分子标记中的应用。【方法】采用AFLP技术,以具有不同果皮颜色的茄子及近缘种为材料,采用单株检测和混合品系法分别筛选与茄子果皮颜色相关基因连锁的分子标记。【结果】对58份高代自交系材料进行单株检测(亲缘关系分析),筛选到了1个与茄子紫红、紫黑果色相关的共显性标记。测序结果表明,片段长度分别为107和108bp,为发生插入/缺失突变的同源序列;将其转化为SCAR标记,对136份茄子材料进行验证,在其中111份紫红、紫黑皮色材料中,相关符合率为90%,在白色及绿色材料中表现为不规律分布。最后以混合品系法,在两池内进一步筛选到了6个多态性标记,对6个标记进行单株验证,确定了它们与紫红、紫黑果色相关。【结论】本试验所获得的SCAR标记、AFLP标记可以用于茄子果色分子标记辅助育种。

葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析

利用葡萄无核基因的特异探针１８ｂｐ,通过ＰＣＲ扩增获得了与葡萄无核基因相连锁的ＳＣＡＲ标记约５９０ｂｐ,采用自动荧光ＤＮＡ测序仪对该片段的核苷酸组成进行双向测序,来自无核白的无核基因特异标记由５６９对核苷酸组成。该标记可以作为合成探针和设计特异引物进行ＰＣＲ扩增的基础,用于检测葡萄育种材料和无核品种的无核性。

铁皮石斛的SCAR标记研究

目的:建立快速准确的铁皮石斛DNA分子鉴定方法。方法:采用RAPD方法对11种石斛进行多态性分析,获得铁皮石斛特异的RAPD分子标记片段;经克隆、测序,重新设计一对特异性引物转化成稳定的SCAR标记。结果:获得了1条稳定扩增的铁皮石斛特异的片段DS-302,序列测定结果表明,全长302 bp,通过BLAST搜索、同源性比较,结果表明该段序列与已知数据库中的所有序列无显著同源性。根据该序列设计1对特异引物,对11种石斛进行扩增,可在铁皮石斛中扩增获得约300 bp的片段,而石斛属其他种未出现该条带。结论:DS-302成功转化为SCAR分子标记,可对铁皮石斛进行快速有效的鉴定。

小麦抗白粉病基因Pm6的RAPD标记和SCAR标记

用 1 8 1条 1 0碱基随机引物扩增感病亲本豫麦 1 3号和含Pm6基因的抗病亲本Tim galen ,有 37条引物在Timgalen中检测到多态性片断 ,经多次重复和F2 验证 ,引物S1 38仍能在Timgalen中扩增出稳定的多态性片断 ,对该多态性片断进行回收、克隆和测序 ,根据其序列合成 1对特异引物 ,成功地将RAPD标记转化成稳定的SCAR标记 ,并用此引物对豫麦 1 3号和Timgalen的杂交F2 单株检测 ,计算出该标记与抗病基因之间的遗传距离为 2 7.1cM。并对含不同抗白粉病基因的载体品种进行了SCAR分析。