抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及其在人舌鳞癌SCC-4细胞系中的表达

目的:构建抑癌基因PTEN真核表达载体pEGFP-PTEN,并观察其在人舌鳞癌scc-4细胞系中的表达,为舌鳞癌的基因治疗提供理论依据。方法:提取人HeLa细胞总RNA,采用RT-PCR法获取PTEN全基因,克隆至pMD18-T载体,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-PTEN重组质粒。双酶切及测序鉴定后,经脂质体介导转染至体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达;Western blotting法检测细胞内PTEN蛋白的表达。结果:pEGFP-PTEN重组质粒双酶切,克隆的目的基因片段约为1 200bp,测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致;荧光显微镜下观察到pEGFP-PTEN在SCC-4细胞系中成功表达;Western blotting结果,转染组PTEN蛋白表达强度为1.07±0.15,与空转染组(0.62±0.11)和未转染组(0.57±0.08)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建pEGFP-PTEN重组真核表达载体,该载体能在人舌鳞癌SCC-4细胞系中表达。

二甲双胍对于人口腔鳞癌SCC-4和CAL-27细胞株的抑制作用

目的:探讨二甲双胍对于人口腔鳞癌SCC-4和CAL-27细胞的抑制作用。方法:对口腔鳞癌SCC-4细胞株和CAL-27细胞株进行复苏、培养和传代处理,运用MTT检测法、流式细胞术检测法、Western blot检测法,观察二甲双胍对人口腔鳞癌SCC-4和CAL-27细胞的体外增殖能力、细胞活性、克隆形成以及生长周期的影响。结果:SCC-4和CAL-27在二甲双胍干预48 h后细胞活性降低,且呈现明显的浓度依赖性;SCC-4和CAL-27在5 mmol/L浓度的二甲双胍干预12、24、48 h后,G0/G1期所占比例随时间推移而逐渐增高(P<0.05),但S期和G2/M期所占的比例却减小(P<0.05);SCC-4和CAL-27经二甲双胍处理2周后,细胞的克隆数显著减少,且呈现明显的浓度依赖性(P<0.05);SCC-4和CAL-27经5 mmol/L二甲双胍干预后,AMPKa憐酸化水平(Thrl72)显著提升,mTOR及其下游直接作用分子p-m TOR(Ser2448)、p-S6Kl(Thr389)、p-4E-BPl(Thr37/46)表达量显著下降,且有时间依赖性。结论:二甲双胍主要通过激活AMPK信号通路而抑制m TOR信号通路,来抑制口腔鳞癌SCC-4和CAL-27细胞的细胞活性,细胞增殖和克隆形成,使口腔鳞癌SCC-4和CAL-27细胞生长阻滞在G0/G1期,从而达到治疗口腔鳞癌的目的。