虫草素抑制PI3K通路的活化诱导口腔鳞状细胞癌SCC9细胞自噬性死亡

目的探究虫草素(CP)对口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系自噬相关的作用和机制。方法实验设置SCC9 blank组、CP(5μg/ml)组、CP(10μg/ml)组和CP(20μg/ml)组。通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞增殖,通过Hoechst染色检测细胞凋亡,通过Western blot检测Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9、Beclin 1、p62、LC3A/B、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达,通过免疫荧光检测细胞自噬标志分子LC3Ⅱ表达。添加PI3K抑制剂LY294002后,通过EdU染色检测细胞增殖,通过Hoechst染色检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞自噬标志分子LC3Ⅱ表达。结果与SCC9 blank组比较,各CP处理组细胞发生明显增殖抑制,并且伴随着凋亡发生,增殖相关分子表达下调,凋亡相关分子表达上调,并且伴随着CP使用浓度升高差异增加(P<0.01);自噬促进相关分子(Beclin 1、LC3Ⅱ)表达上调,自噬抑制相关分子p62表达下调,且自噬通路上游信号分子(PI3K/AKT/mTOR)活性降低,并且伴随着CP使用浓度升高差异增加(P<0.01);与CP处理相比,LY294002联合CP处理后细胞发生明显增殖抑制,促进凋亡和自噬。结论CP可以提高口腔鳞状细胞癌自噬水平,并可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡发生;主要原因可能是通过下调PI3K/AKT/mTOR通路来发挥作用。

miR-21调控PTEN/AKT信号通路对SCC9细胞凋亡的影响

目的:观察舌鳞状细胞癌患者血清miR-21变化水平,利用SCC9细胞探讨miR-21调控染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物/蛋白激酶B(PTEN/AKT)信号通路影响细胞凋亡的作用机制。方法:选取中国人民解放军联勤保障部队第九O九医院收治的舌鳞状细胞癌患者31例和健康体检者31例分别作为观察组和对照组。实时荧光定量PCR(qPCR)检测两组受试者血清miR-21相对表达量。体外培养舌鳞状SCC9细胞,分为miR-21 NC组、miR-21 mimics组和miR-21 inhibitors组并用相应的质粒进行转染,采用qPCR检测miR-21相对表达量,免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测PTEN、AKT和p-AKT蛋白的相对表达量,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:观察组血清miR-21相对表达量高于对照组(P=0.000)。与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组miR-21相对表达量、p-AKT蛋白相对表达量均升高(均P<0.05),PTEN蛋白、细胞凋亡率均降低(P<0.05);miR-21 inhibitors组miR-21相对表达量、p-AKT蛋白相对表达量均降低(均P<0.05),PTEN蛋白、细胞凋亡率均升高(P<0.05)。结论:舌鳞状细胞癌患者血清miR-21相对表达量高于正常人,下调miR-21可能通过抑制PTEN/AKT信号通路促进癌细胞的凋亡。

人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P<0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P<0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P<0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P<0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。

TET对舌鳞癌细胞SCC9生长、运动和裸鼠体内成瘤的影响及机制研究

目的探究汉防己甲素(TET)对舌鳞癌细胞SCC9生长、运动和裸鼠体内成瘤的影响及机制。方法体外培养人舌鳞癌细胞SCC9,分为空白对照组、低剂量TET组(TET 2.5μmol/L)、中剂量TET组(TET 5μmol/L)、高剂量TET组(TET 10μmol/L),分别使用对应剂量的TET预处理。使用克隆形成实验检测细胞生长;使用流式细胞术检测细胞凋亡情况;使用Transwell检测细胞侵袭情况;使用Western blot检测Ki67、CaspasE-3、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。选取裸鼠60只,采用0.002%4-硝基喹啉-1-氧化物自然饮水喂养36周诱发建立舌鳞癌动物模型,分别使用低剂量TET 12.5 mg/(kg·d)、中剂量TET 25 mg/(kg·d)和高剂量TET 50 mg/(kg·d)灌胃处理,29 d后检测瘤子重量,免疫组化染色检测舌鳞癌组织Ki67、Caspase-3和VEGF的表达。结果与空白对照组比较,使用TET处理后舌鳞癌细胞克隆形成率、单位面积内侵袭细胞数目,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达降低,且高剂量TET组低于中剂量TET组,中剂量TET组低于低剂量TET组;与空白对照组比较,其他各组PI3K、AKT及mTOR蛋白表达水平差异无统计学意义;与空白对照组比较,使用TET处理后Caspase-3蛋白表达水平升高,且高剂量TET组高于中剂量TET组,中剂量TET组高于低剂量TET组。小鼠体内实验可以看出,与空白对照组相比,使用TET灌胃处理的裸鼠肿瘤质量、Ki67蛋白表达水平及阳性率、VEGF蛋白表达水平及阳性率降低(P<0.05),且灌胃浓度越高上述指标越低;与空白对照组比较,使用TET灌胃处理的裸鼠Caspase-3蛋白表达水平及阳性率升高(P<0.05),且灌胃浓度越高上述指标越高。结论 TET可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制舌鳞癌细胞的生长、运动,促进舌鳞癌细胞的凋亡,在一定浓度范围内呈浓度依赖性。

沉默calnexin对舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨沉默内质网应激相关蛋白calnexin对舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法将calnexin siRNA转染到舌鳞状细胞癌细胞SCC9和SCC25中,采用qRTPCR检测calnexin表达情况;Western blot实验进一步验证calnexin siRNA沉默效果。通过CCK8实验检测沉默calnexin对舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响;运用Transwell法检测沉默calnexin对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果qRTPCR显示calnexin siRNA能够有效沉默calnexin的表达;Western blot实验进一步证实calnexin siRNA对calnexin的沉默效果。CCK8实验显示沉默calnexin表达的第4天,第5天能够抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.01);Transwell实验提示沉默calnexin的表达能够抑制舌鳞状细胞癌细胞的侵袭和迁移(P<0.001)。结论沉默calnexin可抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

绞股蓝总皂苷对口腔鳞状癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探究绞股蓝总皂苷(Gyp)对口腔鳞状细胞癌细胞系SCC9增殖和凋亡的影响,并初步探讨相关机制。方法用不同浓度Gyp(70、85、100μg/ml)培养SCC9细胞系,未用Gyp处理作为对照组(Ctrl组),MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光定量实时PCR和蛋白免疫印迹检测细胞中Notch1和Jagged1 mRNA和蛋白表达。结果 Gyp浓度分别为70、85、100μg/ml时,SCC细胞增殖率分别为62.15±8.13、50.08±7.14、24.83±5.63,均显著低于Ctrl组(P<0.05);细胞凋亡率分别为23.54±2.17、37.01±3.62、60.03±7.85,均显著高于Ctrl组(P<0.05);Notch1 mRNA表达分别为2.24±0.17、2.46±0.23、2.97±0.31,蛋白表达分别为0.98±0.08、1.26±0.09、1.71±0.13,均显著高于Ctrl组(P<0.05);Jagged1 mRNA表达分别为0.94±0.11、0.51±0.09、0.26±0.06,蛋白表达分别为1.43±0.15、0.73±0.08、0.24±0.06,均显著低于Ctrl组(P<0.05);SCC9细胞荧光强度分别为65.69±11.32、113.12±15.94、163.32±19.48,均显著高于Ctrl组(P<0.05)。结论 Gyp以剂量依赖的方式抑制OSCC细胞系SCC9的增殖并诱导其凋亡,其中Notch信号通路活化在这一过程中起重要作用。