转GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析

从野生大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选并克隆到GsCBRLK基因,与人工合成的高甲硫氨酸含量SCMRP基因构建成双价植物表达载体,将其转入苜蓿,获得超量表达的转基因苜蓿,并进行耐碱性分析。结果显示,经过100、150 mmol L–1 NaHCO3处理14 d后,转基因株系生长状态良好,而非转基因对照株系萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05),而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P<0.05),说明超量表达GsCBRLK基因增强了苜蓿的耐碱能力;各转基因株系的甲硫氨酸含量均比对照植株高,表明SCMRP基因的导入提高了苜蓿叶片甲硫氨酸的含量。

转GsGST13/SCMRP基因双价苜蓿的耐盐性分析

本研究是将从野大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选得到的GsGST13基因和采用生物信息学方法改造的高甲硫氨酸蛋白基因SCMRP构建成双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化农菁1号苜蓿,获得超量表达的转基因苜蓿,并对其中2个转基因苜蓿株系进行耐盐性分析及氨基酸组分分析。结果显示,转基因苜蓿具有较强的耐盐性,表现为随着盐浓度的升高,野生型苜蓿盐害不断加重,生长发育受抑制,叶片逐渐变黄、卷曲、萎蔫,而转基因苜蓿只受到轻微影响,仍能正常生长。转基因株系的丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于非转基因株系(P<0.05),而株高,鲜重,GST活性和SOD活性显著高于非转基因对照(P<0.05,P<0.01);同时株系G16和G50的含硫氨基酸含量分别比野生型植株提高了0.57%和0.52%。说明超量表达GsGST13/SCMRP基因增强了苜蓿的耐盐性,并提高了含硫氨基酸含量。

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。