黑脊倒刺鲃scp3基因的克隆及其表达

为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类黑脊倒刺鲃中克隆出了生殖细胞减数分裂Ⅰ相关基因scp3的部分同源序列scscp3:该序列长477bp,编码159个氨基酸.经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼scp3蛋白等具有高度的同源性.不同组织RT-PCR结果显示:scscp3基因仅在生殖细胞中表达,可将其作为生殖细胞的标记基因,用于鱼类生殖发育的研究.RNA原位杂交结果表明:在精子发生中,scscp3基因均是在精原细胞和初级精母细胞中表达,在后期的精子细胞中未发现表达.而在卵子发生中,scscp3基因在卵原细胞和卵母细胞的各个时相中均有表达,并且在卵原细胞和前期的卵母细胞中表达强烈,在后期时相的卵母细胞中阳性信号逐渐减弱,且向细胞边缘聚集.

SCP3作为栉孔扇贝初级精母细胞标记分子的研究

为检验SCP3在无脊椎动物中是否可以标记特定的生殖细胞,实验利用RACE技术克隆了栉孔扇贝SCP3(Cf-SCP3)的全长cDNA序列,结果显示,其长度为1 033 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含SCP3保守的Cor1结构域和卷曲螺旋结构域。制备了Cf-SCP3地高辛标记的RNA探针和Cf-SCP3重组蛋白的多克隆抗体,采用原位杂交和免疫组织化学技术检测其细胞学定位,结果显示Cf-SCP3转录本和Cf-SCP3蛋白均特异性地定位在栉孔扇贝的初级精母细胞和未受精卵中,在精巢的其他类型细胞和卵巢中均未见表达信号。研究表明,Cf-SCP3蛋白可能与脊椎动物的SCP3蛋白一样,作为联会复合体的组成成分参与栉孔扇贝的配子发生,同时可以作为一个栉孔扇贝初级精母细胞的分子标记应用到体外诱导生殖细胞分化的研究。

黄颡鱼Scp3基因全长cDNA的克隆和表达模式研究

本研究采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长江流域重要的经济鱼类黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)中克隆了与减数分裂密切相关基因Scp3的全长cDNA,并对它的序列、系统进化、组织和细胞表达模式进行了研究。克隆得到的Scp3cDNA全长为1 143bp,编码240个氨基酸;系统进化分析表明黄颡鱼Scp3蛋白与同为鲇形目(Siluriformes)的斑点叉尾鮰(Ietalurus punetatus)Scp3蛋白同源性最高;序列分析结果表明,黄颡鱼Scp3蛋白含有脊椎动物Scp3蛋白保守的卷曲螺旋结构域(Coiled coil domain)和2个保守基序(CM1和CM2);组织和细胞表达模式的研究显示Scp3基因仅表达于黄颡鱼雌雄性腺:1)在精巢中仅表达于初级精母细胞和次级精母细胞;2)在卵巢中仅在初级生长期和卵黄发生前期表达。本文首次从黄颡鱼中克隆得到Scp3全长cDNA并对其进行组织和细胞表达模式的研究,为后续研究脊椎动物生殖细胞的分化及其相互作用奠定了基础。

SCP_3在小鼠精母细胞核内的表达及定位

目的探讨SCP3蛋白在雄性小鼠减数分裂各阶段精母细胞核内的表达及定位。方法采用免疫组织化学染色法初步检测SCP3蛋白在曲细精管中的细胞定位,进一步利用免疫荧光FITC/DAPI共染技术显示该蛋白在减数分裂各阶段精母细胞核内的表达。结果免疫组织化学染色结果显示,在完整的曲细精管内只有精母细胞呈阳性染色。免疫荧光分析证实在减数分裂Ⅰ前期的细线期、偶线期、粗线期及双线期精母细胞核内均有明显的SCP3绿色荧光信号,并且在不同分裂阶段的细胞核内阳性着色条带的数目、状态不同。在处于终变期及中期I的精母细胞核内,只有散在的片状或点状荧光信号,直至后期I阶段完全消失。结论SCP3蛋白在雄性小鼠减数分裂各阶段精母细胞核内的表达与SC的形成、成熟、解体同步,参与了同源染色体之间的联会和重组。

miR-100对儿童急性髓系白血病细胞增殖和分化的影响

目的从miR-100的基因调控水平探索儿童急性髓系白血病(AML)发生和发展机制。方法收集48例初发AML患儿及5例非血液病患儿的骨髓样本,用qRT-PCR方法研究miR-100在AML细胞中的表达,并筛选其可能的靶基因;用Northern Blot、慢病毒构建等体外实验验证miR-100与SCP3之间的靶对关系;分析miR-100基因调控的分子机制。结果在AML细胞中,miR-100显著高表达;高表达miR-100可阻滞HL-60细胞的分化;miR-100的靶基因是SCP3,它通过转录后抑制作用抑制SCP3蛋白的合成;miR-100通过调控其靶基因SCP3,抑制AML细胞的分化并促进其增殖。结论 miR-100参与AML的发生和发展,有可能成为今后治疗AML的新靶标,为治疗儿童AML提供了新思路。

小鼠初级精母细胞减数分裂前期联会复合体观察

【目的】通过SCP3蛋白免疫荧光染色法,研究小鼠初级精母细胞减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体的形态变化。【方法】从小鼠睾丸取曲细精管,用铺展法制片,对初级精母细胞SCP3蛋白进行免疫荧光染色,观察减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体的形态变化。【结果】在细线期,可见短小、不连续而杂乱簇聚的SCP3蛋白片段;在偶线期,SCP3蛋白趋于明显,连续并呈线状,但没有形成完整的联会复合体;在粗线期,SCP3蛋白结构完整而清晰,小鼠初级精母细胞联会复合体共有20条,包括19条常染色体联会复合体和1条XY联会复合体;双线期,构成联会复合体的2条SCP3蛋白开始相互排斥而分离,导致联会复合体开始解体,但此时的二价体结构依然清晰可见。【结论】SCP3蛋白免疫荧光染色是研究减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体形态变化的强有力工具。

类胚体诱导脐带间充质干细胞向生殖细胞的分化

背景:脐带间充质干细胞能否在体外和体内微环境条件下衍生为卵母细胞,对女性生殖的维持及卵母细胞的再生均具有十分重要的意义。目的:进一步验证体外微环境类胚体对脐带间充质干细胞向生殖细胞分化的影响。方法:将脐带间充质干细胞进行悬滴培养,使其形成类胚体,进而采用将类胚体与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液条件培养基培养等方法,体外诱导脐带间充质干细胞向早期生殖细胞分化。结果与结论:①将脐带间充质干细胞进行悬滴培养,其能够形成类胚体。②流式细胞仪检测结果:类胚体形成5d后,其中SSEA-1阳性细胞占15.61%。③免疫组织化学检测结果:形成5d的类胚体与人或小鼠的卵巢颗粒细胞共培养,10d后生殖系标记物SCP3、生长分化因子9阳性表达,而颗粒细胞及采用卵泡液培养的类胚体均无表达。结果表明,脐带间充质干细胞体外悬滴培养可形成类胚体,与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养后均表达生殖系特异性标记物。