二烯丙基二硫对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞的影响

观察二烯丙基二硫(DADS)对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞的影响,除空白对照组外,其余各组加入IL-1β(10 ng/m L)诱导24 h后换DADS处理,通过CCK8实验、平板克隆实验检测增殖能力,Western blot实验检测MMP13、TIMP1和CollagenⅡ蛋白表达水平。结果发现:12.5和25μmol/L DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞有增殖作用(P<0.05),50和100μmol/L DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞有抑制作用(P<0.05);12.5和25μmol/L DADS显著增加IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞克隆集落形成能力(P<0.05),50μmol/L DADS显著抑制IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞克隆集落形成能力(P<0.05);DADS能显著抑制MMP13的表达,增加TIMP1和CollagenⅡ的表达。以上结果提示DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞具有双向调节作用,25μmol/L DADS保护关节软骨细胞的分子机制可能与DADS显著抑制MMP13的表达,增加TIMP1和CollagenⅡ的表达相关。

白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价

背景:建立骨性关节炎软骨细胞模型,对进一步解释骨性关节炎的病理过程,评估和筛选骨性关节炎治疗药物具有重要意义。目的:评价白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果,为进一步探索药物治疗骨性关节炎提供参考。方法:取3周龄SD大鼠髋关节软骨,机械剪切和酶消化分离软骨细胞并进行鉴定。软骨细胞随机分为3组:对照组、5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β组,分别诱导24 h和48 h。MTT法检测软骨细胞的增殖活力;Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白表达。结果与结论:①成功分离并培养原代大鼠软骨细胞;②10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h可使细胞增殖活力显著下降(P<0.05),5 ng/mL白细胞介素1β组则需诱导48 h;③Real-Time PCR结果显示,同对照组相比,5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24,48 h,Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达水平均显著增加(P<0.05);相比10 ng/mL组,5 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞48 h可显著增加基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达(P<0.05);④Western blot结果显示,相比对照组,10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h,Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9蛋白水平显著下降(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白水平显著增加(P<0.05);5 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞48 h,Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9蛋白水平显著下降(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白水平显著增加(P<0.05);⑤提示干预24 h后10 ng/mL白细胞介素1β对软骨细胞的诱导效果可能更明显;干预48 h后5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β的诱导效果相似。

针刀调控线粒体途径软骨细胞凋亡防治大鼠膝骨关节炎

背景:针刀治疗膝骨关节炎的疗效确切,但其作用机制并不十分明确。目的:基于破骨细胞相关受体-肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体-骨保护素(OSCAR-TRAIL-OPG)途径分析针刀对膝骨关节炎大鼠膝关节软骨细胞凋亡的影响。方法:采用随机数字表法将27只SD大鼠分为正常组(9只)、模型组(9只)、针刀组(9只),正常组大鼠常规饲养,不进行任何处理;模型组、针刀组采用膝关节内注射木瓜蛋白酶建立左后肢膝骨关节炎模型,造模成功后给予针刀组大鼠针刀干预,1次/周,共3次。干预结束后进行相关检测。结果与结论:①与正常组相比,模型组大鼠Lequesne MG行为学评分升高(P<0.01);与模型组相比,针刀组大鼠Lequesne MG行为学评分降低(P<0.01)。②苏木精-伊红染色显示与正常组相比,模型组大鼠膝关节软骨表面磨损且不平整,软骨细胞肿胀、破裂且数量减少,细胞排列杂乱;针刀组大鼠膝关节软骨表面较为平整,软骨细胞数量较多且排列较规整,结构基本清晰。③免疫组化染色显示与正常组相比,模型组大鼠膝关节软骨组织中OSCAR、TRAIL阳性表达增加(P<0.01),OPG阳性表达减少(P<0.01);与模型组相比,针刀组大鼠膝关节软骨组织中OSCAR、TRAIL阳性表达减少(P<0.01),OPG阳性表达增加(P<0.01)。④TUNEL染色显示与正常组相比,模型组软骨细胞凋亡数量增加(P<0.01);与模型组相比,针刀组软骨细胞凋亡数量减少(P<0.01)。⑤RT-qPCR与Western blot检测显示与正常组相比,模型组大鼠关节软骨组织中OSCAR、TRAIL、Bax表达升高(P<0.01),OPG、Bcl-2表达降低(P<0.01);与模型组相比,针刀组大鼠关节软骨组织中OSCAR、TRAIL、Bax表达降低(P<0.01),OPG、Bcl-2表达升高(P<0.01)。⑥针刀干预可减轻膝骨关节炎大鼠关节软骨组织损伤,该作用可能与OSCAR-TRAIL-OPG通路阻断线粒体途径凋亡信号释放有关。

蠲痹方含药血清对绝经后膝骨关节炎大鼠软骨细胞自噬的影响及其作用机制

目的:探讨蠲痹方含药血清对绝经后膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠软骨细胞自噬的影响及其作用机制。方法:①绝经后KOA动物模型的建造和蠲痹方含药血清的制备。采用摘取大鼠卵巢,并切断膝关节内侧副韧带、前交叉韧带,摘除膝关节内侧半月板的方法,建造绝经后KOA大鼠模型。造模成功后,对模型大鼠进行蠲痹方浓缩液灌胃,制备蠲痹方含药血清。②大鼠软骨细胞的提取。分别取正常大鼠和模型大鼠的膝关节软骨分离、提取软骨细胞。③蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选。将模型大鼠软骨细胞分为模型组及1.25%、2.5%、5%、10%、20%含药血清组6组,除模型组外,其余各组分别加入相应体积分数的蠲痹方含药血清干预24 h。检测各组软骨细胞的活力,筛选蠲痹方含药血清最佳作用浓度。④蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞G蛋白耦联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)表达影响的检测。将模型大鼠软骨细胞分为模型组及1.25%、2.5%、5%、10%含药血清组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组。除模型组和空白组外,其他各组软骨细胞用相应体积分数的蠲痹方含药血清干预24 h。检测各组大鼠软骨细胞GPR30的相对表达量。⑤蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达和AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路影响的检测。将模型大鼠软骨细胞分为模型组、含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组。除模型组和空白组外,含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组分别用10%蠲痹方含药血清、10%蠲痹方含药血清+Compound C及Compound C干预24 h。检测各组软骨细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3β(microtubule-associated protein light chain 3 beta,MAPLC3β)、Beclin-1、p62,及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白磷酸化AMP活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)的相对表达量。结果:①动物模型鉴定结果。造模8周后,可见造模大鼠膝关节表面软骨毛糙或缺损,关节间隙变窄,滑膜增生,绝经后KOA大鼠模型造模成功。②软骨细胞鉴定结果。甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定结果显示,所提取的细胞符合软骨细胞特征。③蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选结果。5%、10%、20%含药血清组细胞活力均高于1.25%、2.5%含药血清组和模型组(LSD-t=6.767,P=0.003,LSD-t=7.666,P=0.002,LSD-t=5.091,P=0.007;LSD-t=5.080,P=0.007,LSD-t=6.690,P=0.003,LSD-t=3.433,P=0.027;LSD-t=7.590,P=0.002,LSD-t=8.200,P=0.001,LSD-t=6.031,P=0.004);10%含药血清组细胞活力高于5%含药血清组和20%含药血清组(LSD-t=3.204,P=0.033,LSD-t=4.671,P=0.010)。④蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞GPR30表达影响的检测结果。模型组GPR30相对表达量低于空白组及5%、10%含药血清组(LSD-t=5.695,P=0.005,LSD-t=5.400,P=0.006,LSD-t=9.006,P=0.001),5%、10%含药血清组GPR30相对表达量均高于1.25%含药血清组(LSD-t=2.782,P=0.049,LSD-t=4.473,P=0.011),10%含药血清组GPR30相对表达量高于2.5%含药血清组(LSD-t=4.544,P=0.011)。⑤蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达影响的检测结果。模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组MAPLC3β相对表达量均低于空白组、含药血清组(LSD-t=6.855,P=0.002,LSD-t=8.675,P=0.001;LSD-t=5.096,P=0.007,LSD-t=5.931,P=0.004;LSD-t=5.560,P=0.005,LSD-t=5.354,P=0.006);模型组、Compound C组MAPLC3β相对表达量均低于含药血清+Compound C组(LSD-t=4.627,P=0.010,LSD-t=8.677,P=0.001)。模型组、Compound C组Beclin-1相对表达量低于空白组、含药血清组、含药血清+Compound C(LSD-t=12.912,P=0.000,LSD-t=7.401,P=0.002,LSD-t=5.360,P=0.006;LSD-t=2.950,P=0.042,LSD-t=5.484,P=0.005,LSD-t=3.903,P=0.018);含药血清+Compound C组Beclin-1相对表达量低于空白组(LSD-t=26.840,P=0.000)。含药血清组、空白组p62相对表达量低于模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=3.925,P=0.017,LSD-t=3.985,P=0.019,LSD-t=0.016,P=0.001;LSD-t=3.149,P=0.035,LSD-t=5.094,P=0.007,LSD-t=8.740,P=0.001),含药血清+Compound C组p62相对表达量低于Compound C组(LSD-t=3.455,P=0.026)。⑥蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞AMPK/mTOR信号通路影响的检测结果。含药血清组p-AMPK相对表达量高于模型组、Compound C组(LSD-t=3.623,P=0.022,LSD-t=6.537,P=0.003),空白组p-AMPK相对表达量高于模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=4.149,P=0.014,LSD-t=2.791,P=0.049,LSD-t=5.734,P=0.004),含药血清+Compound C组p-AMPK相对表达量高于Compound C组(LSD-t=5.958,P=0.004)。空白组、含药血清组、含药血清+Compound C组p-mTOR相对表达量均低于模型组(LSD-t=8.722,P=0.001,LSD-t=8.849,P=0.001,LSD-t=5.558,P=0.005),含药血清组、空白组p-mTOR相对表达量均低于含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=4.201,P=0.014,LSD-t=10.030,P=0.001;LSD-t=4.879,P=0.008,LSD-t=9.782,P=0.001),含药血清+Compound C组p-mTOR相对表达量低于Compound C组(LSD-t=6.934,P=0.002)。结论:蠲痹方含药血清作用于绝经后KOA大鼠软骨细胞,可增加细胞活力,并通过上调MAPLC3β、Beclin-1的表达和抑制p62的表达增强细胞自噬能力;其作用机制可能与促进GPR30表达,上调AMPK磷酸化水平,下调mTOR磷酸化水平,激活GPR30和AMPK/mTOR信号通路有关。

高良姜素调节SIRT1/AMPK/mTOR信号通路对脂多糖诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨高良姜素调节沉默信息调节因子1(SIRT1)/增强腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法将大鼠关节软骨细胞分为对照组,模型组(1.0μg·mL^(-1)LPS),高良姜素低(1.0μg·mL^(-1)LPS+10μmol·L^(-1)高良姜素)、中(1.0μg·mL^(-1)LPS+20μmol·L^(-1)高良姜素)、高(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素)剂量组,高良姜素高剂量+EX527(SIRT1抑制剂)组(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素+40μmol·L^(-1)EX527)。用流式细胞术检测关节软骨细胞凋亡;丹酰尸胺(MDC)染色观察关节软骨细胞自噬;酶联免疫吸附法检测细胞中白细胞介素1β(IL^(-1)β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6水平;Western Blot法检测苄氯素(Beclin)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、SIRT1、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、mTOR、p-mTOR表达情况。结果与对照组比较,模型组MDC阳性细胞比例,Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均降低(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值均升高(P<0.05)。与模型组比,高良姜素低、中、高剂量组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均增加(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达及p-mTOR/mTOR比值均降低(P<0.05)。与高良姜素高剂量组比较,高良姜素高剂量+EX527组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达以及p-AMPK/AMPK比值明显降低(P<0.05),细胞凋亡率IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值明显升高(P<0.05)。结论高良姜素能促进LPS诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,可能是通过激活SIRT1/AMPK/mTOR信号通路发挥作用。

肾虚血瘀型SD大鼠膝骨关节炎模型的建立与验证

背景:肾虚血瘀证候作为膝骨关节炎常见中医证候,又是膝骨关节炎的基本病机,二者之间有着重要联系。但肾虚血瘀证候如何促进膝关节软骨损伤及其潜在机制并不明确,还需进一步研究。目的:探讨肾虚血瘀证候对SD大鼠膝骨关节炎进程的影响。方法:将16只SD大鼠随机分为模型观察组和对照组,每组8只。模型观察组采用卵巢摘除方法建立肾虚模型,2个月后采用改良HULTH手术进行膝骨关节炎造模,HULTH手术后1周皮下注射盐酸肾上腺素进行血瘀造模;对照组给予卵巢摘除假手术,改良HULTH手术,皮下注射生理盐水。HULTH手术后第5周,检测血液流变学、凝血四项、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸及雌二醇水平;同时,拍摄膝关节X射线片,进行膝关节苏木精-伊红染色、番红-固绿染色和免疫组化染色。结果与结论:①与对照组相比,模型观察组全血黏度低切、中切、高切和血浆黏度显著升高,凝血四项中纤维蛋白原水平显著升高,凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间显著下降;三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸及雌二醇水平均显著下降;②影像学结果显示模型观察组大鼠膝关节间隙狭窄程度更严重且表面欠光滑,出现高密度影;③苏木精-伊红染色和番红-固绿染色表明,模型观察组大鼠软骨损伤更严重,并且OARSI评分和Mankin评分明显高于对照组;④免疫组化染色结果显示,相较于对照组,模型观察组大鼠软骨外基质Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖蛋白表达显著下降,炎症因子基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白表达显著升高。结果表明,该研究成功建立了SD大鼠肾虚血瘀型膝骨关节炎模型;肾虚血瘀证候通过促进炎症因子表达进一步加重软骨外基质裂解和软骨退变,促进大鼠膝骨关节炎进程。

益母草碱对骨关节炎大鼠细胞自噬的机制研究

目的探讨益母草碱对骨关节炎(OA)大鼠软骨细胞自噬和凋亡的影响以及PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)信号通路发挥作用。方法采用标准前交叉韧带横断术(ACLT)构建OA大鼠模型,将建模成功的大鼠分为OA组、益母草碱-L组、益母草碱-M组、益母草碱-H组,每组12只,另取12只为假手术组;HE染色检测各组大鼠软骨细胞形态变化;透射电镜观察各组大鼠软骨细胞超微结构;TUNEL法检测各组大鼠软骨细胞凋亡;RT-qPCR检测各组大鼠软骨组织PINK1、Parkin、P62、LC3B mRNA表达水平;Western blot检测各组大鼠软骨组织PINK1、Parkin、P62、LC3B蛋白表达水平。结果与假手术组相比,OA组大鼠软骨形态异常、结构模糊、表面出现裂缝、软骨细胞线粒体数量减少、少量自噬体存在,软骨细胞凋亡率、软骨组织P62 mRNA和蛋白水平显著升高,软骨组织PINK1、Parkin、LC3B mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)。与OA组比较,益母草碱-L、M、H组大鼠软骨形态逐渐恢复、结构逐渐清晰、表面裂缝减少、软骨细胞数量恢复、线粒体增多、自噬体数量增加,软骨细胞凋亡率、软骨组织P62 mRNA和蛋白水平显著降低,软骨组织PINK1、Parkin、LC3B mRNA和蛋白水平显著升高,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论益母草碱可能通过激活PINK1/Parkin信号通路促进OA大鼠软骨细胞自噬,抑制软骨细胞凋亡。

体外冲击波干预骨关节炎大鼠软骨细胞的增殖和自噬

背景:体外冲击波是一种新兴的治疗方法,被广泛应用于各个医疗领域,对骨关节炎的发生发展具有重要作用。目的:通过研究体外冲击波对大鼠骨关节炎软骨细胞增殖和自噬的影响,探讨体外冲击波在治疗骨性关节炎过程中的作用机制。方法:选取清洁级1周龄SD大鼠,获取四肢关节软骨进行原代软骨细胞的分离与培养。将第3代软骨细胞按随机数表法随机分为对照组(未加任何处理)、白细胞介素1β组(10μg/L白细胞介素1β刺激24 h)、体外冲击波组(1.5×10^(5)Pa体外冲击波干预500次)、白细胞介素1β+体外冲击波组(10μg/L白细胞介素1β刺激24 h后1.5×10^(5)Pa体外冲击波干预500次)。CCK-8法检测各组软骨细胞活力和增殖情况,实时荧光定量PCR法检测各组软骨细胞自噬基因Beclin 1、P62、Atg5和LC3 mRNA的表达。结果与结论:①与对照组相比,白细胞介素1β组软骨细胞活力和增殖能力下降(P<0.05);与白细胞介素1β组相比,白细胞介素1β+体外冲击波组软骨细胞活力和增殖能力有所提高(P<0.05);②与对照组相比,白细胞介素1β组自噬基因Beclin 1、Atg5和LC3的表达下降,P62的表达增加(P<0.05);与白细胞介素1β组相比,白细胞介素1β+体外冲击波组自噬基因Beclin 1、Atg5和LC3的表达显著增加,P62表达下降(P<0.05);③结果表明,体外冲击波可促进骨关节炎软骨细胞增殖,并提高骨关节炎软骨细胞的自噬水平,从而参与调节骨关节炎的进展。

骨髓间充质干细胞基于Rho/ROCK信号通路对膝骨性关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的分析骨髓间充质干细胞(BMSCs)基于鼠抗Ras同源基因(Rho)/Rho相关螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路对膝骨性关节炎(KOA)模型大鼠软骨细胞凋亡的影响。方法随机选取30只健康大鼠,其中正常组10只,模型组10只、BMSCs组10只,分别进行干预。对比各组软骨组织Mankin评分,检测基质金属蛋白酶(MMP)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10、凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及RhoA、ROCK蛋白表达水平,分析BMSCs对KOA大鼠软骨细胞凋亡的影响。结果BMSCs组Mankin评分高于正常组、低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs组血清MMP-1、TNF-α、Bax、RhoA、ROCK表达水平低于模型组、高于正常组,IL-10、Bcl-2表达水平高于模型组、低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs组软骨细胞凋亡指数低于模型组、高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于Rho/ROCK信号通路调控BMSCs可改善KOA大鼠膝关节软骨病理状态、抑制炎症反应蔓延、调控Bax、Bcl-2蛋白表达、抑制软骨细胞凋亡,其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路相关,证实BMSCs具有良好的抗软骨细胞凋亡疗效。

乌头汤对膝骨关节炎大鼠软骨细胞焦亡相关基因表达的影响

目的:探讨乌头汤通过调控软骨细胞炎性焦亡途径延缓膝骨关节炎软骨退变的作用与机制。方法:将36只SD大鼠(雄性,8周龄)随机分为空白对照组、模型对照组和乌头汤组,每组12只。空白对照组不造模,模型对照组和乌头汤组采用改良Hulth法造模。空白对照组与模型对照组采用生理盐水(3 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,乌头汤组采用乌头汤(生药浓度4.2 g·mL^(-1))灌胃。干预8周后,麻醉状态下摘取大鼠膝关节软骨。采用Western blot检测不同组别关节软骨中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的蛋白含量表达;采用Real-time PCR检测不同组别关节软骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的基因相对表达变化。结果:模型对照组和乌头汤组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量与基因相对表达量均上调,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);乌头汤组能够下调NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量与基因相对表达量,与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠软骨NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,抑制软骨细胞焦亡,延缓软骨退变。

推拿对膝关节骨关节炎模型大鼠膝关节软骨白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体相关因子6、细胞核因子信使核糖核酸携带遗传信息及蛋白的影响

目的研究推拿对膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型大鼠膝关节软骨白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、细胞核因子(NF-κBp65)mRNA(信使核糖核酸携带遗传信息)及蛋白的影响,从而探讨推拿治疗膝骨关节炎可能的生物学机制。方法选择12周龄雄性美国斯泼累格·多雷(SD)大鼠27只,采用随机数字表法,选取9只作为正常对照组(n=9),余下18只Ⅱ型胶原酶诱导建立KOA大鼠模型,再利用随机数字表将其分为自然恢复组(n=9)和推拿手法治疗组(n=9)。正常对照组于造模前一天取标本;自然恢复组正常喂养并于第1次造模后4周处死大鼠取标本;推拿手法治疗组以改良后基于SD大鼠的推拿手法进行推拿干预,1次/d,每治疗6 d休息1 d,并于造模后4周处死大鼠取标本(以造模为第0天算起),比较3组大鼠造模4周后的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA及蛋白的相对表达量。结果正常对照组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA及蛋白相对表达量均低于推拿手法治疗组和自然恢复组(均P<0.05),推拿手法治疗组大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA及蛋白相对表达量低于均自然恢复组(均P<0.05)。结论推拿治疗膝骨关节炎疗效显著,其机制可能与推拿能够有效改善膝关节软骨中IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA及蛋白表达水平相关。

miR-125a-3p对骨关节炎大鼠软骨细胞活性、氧化应激反应及SIRT1/Foxo1蛋白表达的影响

目的 探讨miR-125a-3p对骨关节炎大鼠软骨细胞活性、氧化应激反应及细胞沉默信息调节因子1/叉头框转录因子o1(SIRT1/Foxo1)蛋白表达的影响。方法 将40只大鼠随机分为对照组(健康大鼠)、模型组(骨关节炎大鼠,造模后不做其他处理及干预)、miR-125a-3p组(骨关节炎大鼠,造模成功7 d后于大鼠左膝关节关节腔内注射miR-125a-3p抑制剂)、阿利吉仑组(骨关节炎大鼠,造模成功7 d后给予大鼠50 mg/kg阿利吉仑灌胃),每组10只。通过氧化应激反应检测超氧物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、乳酸脱氢酶(LDH),HE、番红O、Masson染色检查大鼠软骨损伤情况,TUNEL检测软骨细胞凋亡,RT-PCR与免疫印迹检测SIRT1、Foxo1基因及蛋白水平。结果 软骨细胞凋亡率模型组高于miR-125a-3p组与阿利吉仑组(P<0.05),miR-125a-3p组与阿利吉仑组比较差异无统计学意义(P>0.05)。HE、番红O、Masson染色显示,模型组大鼠关节软骨面骨裂隙形成;miR-125a-3p组与阿利吉仑组大鼠关节软骨表面变得光滑,无明显裂隙。RT-PCR与免疫印迹检测显示,与模型组相比,miR-125a-3p组与阿利吉仑组SOD、GSH、SIRT1水平均升高(P<0.05), MDA、LDH、Foxo1水平均降低(P<0.05)。结论 miR-125a-3p通过调控SIRT1/Foxo1信号通路,可降低氧化应激反应,抑制软骨细胞凋亡,改善骨关节炎病情。

苍术内酯对骨关节炎大鼠软骨损伤修复和软骨细胞凋亡的影响

目的探讨苍术内酯(AT)对骨关节炎大鼠软骨损伤修复和软骨细胞凋亡的影响及其可能作用机制。方法60只7~8周龄SPF级雄性SD大鼠,48只大鼠采用前后交叉韧带断离术建立骨关节炎(OA)模型,造模成功大鼠采用随机分为模型组、AT低、中、高剂量组,各12只,另设对照组(12只)。AT低、中、高剂量组腹腔注射5、10、20 mg/kg AT,对照组及模型组给予等量生理盐水,连续30 d。观察大鼠软骨组织形态计算Mankin’s评分;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察软骨组织病理学变化;TUNEL法检测大鼠软骨组织细胞凋亡情况;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测大鼠软骨组织中微RNA-98-5p(miR-98-5p)表达、高迁移率族蛋白2(HMGA2)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠HMGA2、GSK-3β、凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达情况。结果模型组大鼠软骨组织HMGA2、GSK-3βmRNA和Bcl-2蛋白表达降低,Mankin’s评分[(8.62±0.69)分]比[(1.71±0.12)分]、TNF-α、IL-1β、IL-6、miR-98-5p、Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率[(47.82±4.26)%比(8.41±1.74)%]显著升高(P<0.05);与模型组比较,AT低、中、高剂量组大鼠软骨组织HMGA2、GSK-3βmRNA和Bcl-2蛋白表达升高,Mankin’s评分[(5.05±0.47)分、(4.68±0.36)分、(2.15±0.23)分]比[(8.62±0.69)分]、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、miR-98-5p、Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率[(32.05±2.84)%、(23.68±2.89)%、(12.15±2.13)%比(47.82±4.26)%]显著降低(P<0.05),且以AT高剂量组效果最佳。结论AT能够调整OA大鼠血清炎性因子水平,抑制软骨细胞凋亡,可能是通过干扰miR-98-5p促进HMGA2、GSK-3β蛋白表达发挥作用。

shRNA沉默RAGE基因对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢的影响

目的研究RAGE基因在骨性关节炎形成中的作用,探讨其对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢的影响。方法通过构建RAGE基因的shRNA表达载体,沉默RAGE基因在骨性关节炎SD大鼠软骨细胞的表达,采用Western blot分别检测空白对照组、空载组、shRNA沉默组中RAGE、p-p38 MAPK、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白水平。结果与空白对照组和空载组(Rc)相比,R1、R2、R3、R4的RAGE、p-p38MAPK、 MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表达水平显著下降(P<0.05);RAGE、p-p38MAPK和MMP-13的蛋白水平在空白对照组和空载组(Rc)间差异无统计学意义;RAGE、ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白水平在空白对照组和空载组(Rc)间差异有统计学意义(P<0.05)结论shRNA沉默RAGE基因表达对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢有明显的抑制作用。

Hedgehog信号通路阻断剂环巴胺体外对佐剂性关节炎大鼠的关节软骨细胞增殖的影响

目的探讨Hedgehog(Hh)信号通路抑制剂环巴胺体外对佐剂性关节炎大鼠(AA)模型的关节软骨细胞增殖的影响和部分机制。方法弗氏完全佐剂诱导AA大鼠,测量关节炎指数和继发性足肿胀度,HE染色观察两组软骨组织生长情况;取AA大鼠踝关节软骨组织,采用胰蛋白酶-胶原酶法分离、培养、鉴定,环巴胺(0、0.05、0.5、5、20μmol/L)体外给药,MTT法检测AA大鼠踝关节软骨细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染检测AA大鼠踝关节软骨细胞凋亡,Western blotting检测AA大鼠踝关节软骨细胞Shh、Ptch1、Gli1的蛋白表达。结果弗氏完全佐剂诱导后,与正常大鼠相比,AA大鼠关节炎指数和继发性足肿胀度明显升高,HE染色显示,AA大鼠踝关节软骨组织有破坏;甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原鉴定体外成功培养AA大鼠踝关节软骨细胞;体外给药环巴胺(0.05、0.5、5、20μmol/L)可升高AA模型关节软骨细胞增殖,流式细胞检测结果显示,环巴胺能降低AA模型软骨细胞凋亡率;与未用环巴胺组相比,环巴胺(0.5、5、20μmol/L)给药对AA软骨细胞中Hh信号通路相关蛋白(Shh、Ptch1、Gli1)表达显著下降。结论弗氏完全佐剂诱导建立AA大鼠模型成立,体外给药环巴胺可抑制AA大鼠软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的凋亡,该作用与抑制AA大鼠软骨细胞Hh信号有关。

透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响

目的:观察透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响。方法:采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,将培养的第3代软骨细胞分为空白组、模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组。空白组不进行干预;模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组先以2μmol·L^(-1)TG干预4 h,然后模型组更换为正常培养基,透骨消痛胶囊高、中、低剂量组分别更换为浓度为100μg·mL^(-1)、50μg·mL^(-1)、25μg·mL^(-1)的含透骨消痛胶囊培养基干预24 h。干预后以MTT法检测各组软骨细胞活性、以AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率、以Western Blot法检测各组软骨细胞中激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartate specific protease 12,Caspase12)和Caspase3的表达量。结果:(1)软骨细胞活性。5组软骨细胞吸光度比较,差异有统计学意义(0.428±0.009,0.226±0.028,0.345±0.025,0.301±0.035,0.269±0.033,F=39.462,P=0.000)。模型组吸光度低于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组吸光度均高于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.022);透骨消痛胶囊中、低剂量组的吸光度均低于高剂量组(P=0.019,P=0.000);透骨消痛胶囊低剂量组与中剂量组比较,差异无统计学意义(P=0.085)。(2)软骨细胞凋亡率。5组软骨细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(3.270±0.231)%,(30.003±4.128)%,(12.383±0.933)%,(15.387±2.961)%,(20.143±3.472)%,F=37.560,P=0.000]。模型组软骨细胞凋亡率高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组软骨细胞凋亡率均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.001);透骨消痛胶囊低剂量组软骨细胞凋亡率低于高剂量组(P=0.007),透骨消痛胶囊高、低剂量组与中剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.216,P=0.063)。(3)软骨细胞内质网应激(PEKR信号通路)关键蛋白含量。5组软骨细胞中ATF4含量比较,差异有统计学意义(0.257±0.028,0.435±0.033,0.315±0.023,0.276±0.038,0.351±0.043,F=13.057,P=0.001)。空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的ATF4含量均低于模型组(P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.012);透骨消痛胶囊低剂量组的ATF4含量高于中剂量组(P=0.022);透骨消痛胶囊高剂量组的ATF4含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.188,P=0.229)。5组软骨细胞中BIP含量比较,差异有统计学意义(0.227±0.026,0.432±0.022,0.294±0.035,0.263±0.020,0.339±0.032,F=25.416,P=0.000)。空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的BIP含量均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.002);透骨消痛胶囊低剂量组的BIP含量高于中剂量组(P=0.006);透骨消痛胶囊高剂量组的BIP含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.185,P=0.072)。5组软骨细胞中Caspase12含量比较,差异有统计学意义(0.252±0.027,0.346±0.028,0.294±0.011,0.315±0.024,0.325±0.019,F=7.345,P=0.005)。模型组的Caspase12含量高于空白组(P=0.001);透骨消痛胶囊高剂量组的Caspase12含量低于模型组(P=0.018);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与模型组比较,差异均无统计学意义(P=0.126,P=0.277);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.277,P=0.126);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量比较,差异无统计学意义(P=0.614)。5组软骨细胞中Caspase3含量比较,差异有统计学意义(0.265±0.028,0.380±0.017,0.317±0.026,0.304±0.019,0.333±0.022,F=10.507,P=0.001)。模型组的Caspase3含量高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的Caspase3含量均低于模型组(P=0.006,P=0.002,P=0.029);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.496,P=0.387),透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量比较,差异无统计学意义(P=0.138)。结论:透骨消痛胶囊能抑制TG诱导的大鼠体外培养关节软骨细胞发生由内质网应激(PEKR信号通路)介导的细胞凋亡,其作用效果与药物剂量无明显关系。

瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达的影响

目的:探讨瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)mRNA表达的影响及其机制。方法:体外培养大鼠膝关节软骨细胞,取第3代细胞采用免疫细胞化学方法及甲苯胺蓝染色法鉴定Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达;MTT法检测不同质量浓度瘦素环境下正常及IL-1β诱导软骨细胞的增殖活力;实时定量PCR法检测不同质量浓度瘦素处理后IL-1β诱导软骨细胞MMP-13 mRNA的表达,ELISA法检测培养基上清肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平;通过小RNA干扰(siRNA)抑制瘦素长型受体(OB-Rb)表达,观察瘦素对MMP-13 mRNA表达的影响。结果:所有细胞均能分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖。MTT结果显示,低质量浓度瘦素对细胞增殖无明显影响,瘦素质量浓度大于等于10 ng·ml-1后可显著促进细胞增殖;而10 ng·ml-1的IL-1β可显著抑制细胞增殖,同时给予100 ng·ml-1及1μg·ml-1瘦素则可进一步抑制细胞增殖,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR结果显示,IL-1β可增加软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌,而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染OB-Rb siRNA的软骨细胞OB-Rb mRNA的表达显著下降(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则不受影响;IL-1β处理对转染组OB-Rb的mRNA表达无明显影响,但可显著诱导MMP-13 mRNA的表达增加(P<0.05),进一步加入瘦素后,OB-Rb mRNA的表达有所增加,但表达量远远低于siRNA未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则未见增加。结论:一定浓度的瘦素可通过与OB-Rb结合促进IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达,具有降解软骨作用。

α黑素细胞刺激素对大鼠胶原性关节炎软骨破坏的抑制作用

目的 :研究 α黑素细胞刺激素 (α- melanocyte- stim ulating horm one,α- MSH)对大鼠胶原性关节炎 (collagen- inducedarthritis,CIA)软骨破坏的保护作用及其机制。 方法 :建立大鼠 CIA动物模型 ,随机分为 3组 :正常对照组 ,CIA组和 α- MSH注射组 ,每组 8只。于致敏建模当天起连续腹腔注射 α- MSH或 PBS,比较各组大鼠组织病理学及 X线放射学表现。收集 CIA组牛 型胶原 (b C )诱导的大鼠淋巴细胞和 L PS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞 ,加入不同浓度的 α- MSH(10 - 1 2～ 10 - 6 mol/ L)后 ,分别培养 4 8h和 2 4 h收集上清 ,应用 EL ISA法测定 IL- 1β和 IL- 10含量 ,MTT法测定 TNF- α浓度 ,硝酸还原酶法测定一氧化氮 (NO)水平。 结果 :α- MSH可改善关节炎大鼠病灶的病理及 X线表现 ,抑制关节软骨破坏。给予α- MSH后 ,CIA大鼠腹腔巨噬细胞和淋巴细胞上清中 IL - 1β、TNF-α及 NO水平明显下降 ,IL - 10含量则明显升高。 结论 :α- MSH对关节炎大鼠软骨破坏具有抑制作用 ,其机制可能与调节细胞因子及

运动负荷对去卵巢大鼠关节软骨细胞Cx43蛋白表达影响的初步研究

目的探讨运动负荷对去卵巢大鼠关节软骨细胞中间隙连接蛋白Connexin43(Cx43)蛋白表达的影响。方法3月龄Sparague-Dawley(SD)大鼠30只,均分为(1)A组(卵巢切除组):行双侧卵巢切除术(n=10);(2)B组(卵巢切除+立即运动组):双侧卵巢切除术后第2周起至第21周,大鼠在小动物跑步台上运动(20m/min×60min/d×6d/周×20周)(n=10);(3)C组(卵巢切除+延迟运动组):双侧卵巢摘除后第14周起至第21周,大鼠在小动物跑步台上运动(20m/min×60min/d×6d/周×8周)(n=10)。各组大鼠均于术后21周末取材膝关节胫骨端,进行Cx43免疫组织化学染色观察,结合图象分析系统及分析软件,观察和分析关节软骨细胞中Cx43蛋白表达及阳性面积百分比(%)。结果Cx43阳性表达定位于相邻软骨细胞的胞浆和/或胞膜上。A组中关节软骨出现退变,软骨细胞数目减少,Cx43阳性表达主要分布于同源软骨细胞群中。B组关节软骨基质较丰厚,软骨细胞数量多,分布清晰,浅层较幼稚的软骨细胞及其深层的同源软骨细胞群中均可见Cx43蛋白阳性表达,尤以关节软骨负重区为典型。C组关节软骨退行性变、基质菲薄、创伤、溃疡,软骨下骨外露、硬化,关节软骨细胞明显减少、退变、形态不规则、分布紊乱,主要残存于关节周缘非负重区,部分尚存的软骨细胞中表达Cx43。A、B、C3组Cx43阳?

健骨伸筋汤对大鼠膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨健骨伸筋汤对大鼠膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法采用改良的Hulth法造模,造模2周后,开始对空白对照组、模型组生理盐水灌胃;对照组壮骨关节丸灌胃;治疗组分低、高浓度进行中药灌胃,第13周处死,通过免疫组化、TUNEL法检测软骨细胞的增殖与凋亡。说明健骨伸筋汤可以通过调节软骨细胞的增殖与凋亡防治骨关节炎。结果健骨伸筋汤方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖指数值明显高于对照组及模型组(P<0.05),软骨细胞凋亡率明显低于对照组及模型组(P<0.05)。结论健骨伸筋汤可以促进软骨细胞的增殖,还可以抑制软骨细胞异常凋亡,从而起到防治骨关节炎的作用。