SD序列矩阵表示与保守性

提出用矩阵形式表示一组核酸序列的方法．以大肠杆菌ＳＤ序列（在起始密码子ＡＴＧ前－１～－２５位点的２５个碱基范围内）为例给出了表示各位点单碱基、相邻双碱基、相邻三碱基出现的矩阵形式，并计算了体现序列的保守性、关联性的Ｍ（ｌ）值，发现大肠杆菌ＳＤ序列保守性，相邻双碱基。

自洽聚类法识别大肠杆菌SD序列

用自洽聚类方法判定大肠杆菌蛋白质编码基因SD序列强弱,给出构成强SD序列的17种碱基关联模式.将全部SD序列按作用强弱不同分为三类:强、中、弱,发现强弱不同时最偏好模式不同,如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式,AAGGA是强SD序列的最偏好模式.同一模式距起始密码子的距离不同时,所起的调控作用也不同,如GGAG模式中的A在强SD序列中位于-8位点,在弱SD序列中位于-7和-9位点.平均来说,各SD序列的-9位点上碱基G出现的概率最大.结果还表明SD序列越强,基因的表达水平越高,SD序列越弱,基因表达水平越低.SD序列与an ti-SD序列的配对程度和相对位置影响起始密码子的识别和翻译效率.

基因串联原核高效表达胸腺肽α1

人工合成含有SD序列、胸腺肽α1(Tα1)基因、纯化标签和酶切位点的DNA序列作为构建元件,利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a(+)中,得到含有1～8个不同重复数目的含SD序列基因的串联表达载体,利用PCR初步鉴定和进一步的测序证实序列完全正确。进而利用lacZ基因作为指示基因,将带有SD序列的lacZ基因克隆到不同Tα1基因串数载体末尾,利用蓝白斑实验验证启动子后不同SD序列的效率,证实串联载体中的各个SD序列均能有效启动翻译。在此基础上对各串表达载体进行摇瓶发酵,SDS-PAGE电泳检测证实各串均可正确表达Tα1,且为可溶性表达,为小肽原核高效表达提出了新方法,有望成为小肽高效表达的新途径。

L─山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列，合成了两个引物序列，以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应，克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因，经酶切验证与预期结果相同，序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法在此基因的两端加上了E．coRI和HindⅢ两个酶切位点，经E．coRI和HindⅢ酶切后去掉了两端的多余序列后，将此片段连接到pKKH上，经诱导无蛋白表达，采用RcaI酶切启动子端，对载体pKKH则采用Mcol酶切，使表达载体的SD序列与起始密码子ATG之间的距离减少了一个碱基，终止子端仍采用HindⅢ酶切，连接后进行转化，得到的阳性克隆经诱导后有明显的蛋白表达条带，酶活力也比对照明显增高。此工作为构建可直接利用L－山梨糖发酵产生维生素C前体2－酮基－L－古龙酸的基因工程菌打下了基础。

改变部分TIR对EPO模拟肽8串联体表达的影响

目的 通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法 设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco RI和 X ba I位点 ,经 DNA测序确定正确重组质粒 ,再将 EPO模拟肽基因 8串联体 (含改建的翻译起始区域 )克隆到 p BV2 2 0载体的 Eco RI和 Bam HI位点 ,诱导表达 .结果 DNA测序证明 ,人工合成的 DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因 8串联体的翻译起始区域 .该串联体基因插入 p BV2 2 0载体后 ,经 42℃诱导 ,在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为 2 2× 10 3(Mr)的新蛋白带 ,与 EPO模拟肽基因 8串联体的理论计算分子量相符合 .经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的 15 % .结论 通过改变部分翻译起始区域起动了 EPO模拟肽基因 8串联体的翻译 ,使原来不表达的 EPO模拟肽基因

提高bFGF基因表达水平的策略及其表达产物的纯化工艺

目的 :通过在同一个表达载体pLX1上调整SD序列和ATG之间距离 ,以提高bFGF目的蛋白表达量。方法 :以Klenow和MungBeanNuclease通过增加 2个及减少 2个碱基调整SD序列和ATG之间距离 ,SDS PAGE和Westernblot检测目的蛋白表达量 ,以高压液相疏水层析、凝胶过滤及肝素亲和层析纯化目的蛋白、MTT法进行活性测定。结果 :获得了重组质粒pLX2 ,pLX3 ,诱导后与表达质粒pLX1( 7.78% )相比 ,表达量分别为 8.0 3 % ,9.9% ,经纯化后获得的bFGF纯度达 98% ,ED50 为 2 .2 9ng/ml。结论 :调整SD序列和ATG之间距离可以增加目的基因的剂量 。

基于rhaSR嵌合操纵子的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

通过PCR等重组DNA技术,构建了含rhaSR启动子表达调控元件、RhaR基因、报告基因gst(谷胱甘肽-S-转移酶)的两个嵌合操纵子,并插入大肠杆菌表达载体pALEX中构成pALEX-PR1和pALEX-PR2。其中pALEX-PR2的RhaR基因上游为原有的SD序列,而pALEX-PR1的RhaR基因上游则插入了增强的SD序列。把这两个重组表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中,报告基因gst能够在L-鼠李糖诱导下表达,其表达量是非诱导条件下的4～5倍,且pALEX-PR1的表达量是pALEX-PR2的3.14倍。以上结果表明,gst的表达既受L-鼠李糖诱导,同时又受RhaR的正调控。SDS-PAGE结果显示,GST占大肠杆菌培养物总可溶蛋白的5.41%(W/W),平均1L培养物可获得3.0mg纯化的GST。酶活性分析表明,所构建的嵌合操纵子表达的GST保持了正确的构型且具有很高的活性。

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF),提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及PCR技术,改变人干细胞因子hSCF cDNA起始密码子ATG与SD序列之间的距离及在翻译起始区(即N端氨基酸)部分采用大肠杆菌(E.coli)喜用型密码子的策略,使重组表达质粒pBV220-hSCF在E.coli中获得高效稳定表达。结果 DNA序列测定证明基因的阅读框架完全正确。重组人干细胞因子的表达量从改造前占E.coli总蛋白的12%提高到40%左右。纯化的重组hSCF N端17个氨基酸测序结果表明,除第一个氨基酸为甲硫氨酸外,其余与天然hSCF序列完全一致。纯化的重组hSCF经Western blot证明,与标准hSCF一致。结论 提示hSCF cDNA的5′侧翼区结构对其基因表达有显著的影响。

高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G上游的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno sequence,SD)替换成翻译起始强度更高的异源SD,同时优化各亚基之间间隔序列的长度,并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过E.coli重组表达系统过表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase进行纯化,并通过凝胶过滤层析确定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件,并建立底物恒速流加的细胞催化工艺,模拟了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase在E.coli中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性为85.5±4.3 U/mg,纯酶比活为234.0±11.7 U/mg,H-NHase相对分子质量为504.5±9.8 k D。细胞催化最适p H为7.5,最适温度为25°C,底物浓度为400 mmol/L。在此条件下,重组菌细胞酶活为256.0±10.4 U/m L,流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase大肠杆菌细胞生长迅速,发酵周期短,应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率,具有潜在的工业价值。