SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳与液质联用技术分离和鉴定小鼠巨噬细胞膜蛋白

用膜蛋白分离试剂盒提取巨噬细胞膜蛋白,然后用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离。将每个泳道平均切成8份,合并两个泳道同样位置的胶条,分别进行胶内酶解。酶解得到的多肽经脱盐后进入毛细管反相柱进行反相分离,分离后的肽段直接进入电喷离子源质谱仪进行一级和二级质谱分析。质谱数据用SEQUEST软件对小鼠IPI蛋白数据库进行检索,得到一个含有1000多种蛋白的名单,其中包括458种经GOA注释的膜蛋白。对膜蛋白部分进一步分析发现,其中包括CD11b、TNF-a、F4/80、CD14、CD18、CD86、CD44、CD16、Toll样受体等已知表达在巨噬细胞表面的蛋白分子,还包括另外13种CD分子和18种Ras相关GTPase,除了这些已知蛋白之外,还鉴定出若干新蛋白分子,为进一步深入研究巨噬细胞生物学功能提供了目标分子。

采用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术鉴别龟甲及其混伪品

目的:从蛋白水平上对龟甲药材及其混伪品进行鉴别,分析龟甲及其混伪品的差异。方法:本研究采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对龟甲及其混伪品进行鉴别,并对龟甲的背甲与腹甲、不同批次正品龟甲药材进行对比分析。结果:对于同一品种的龟甲,其背甲与腹甲的蛋白质亚基相似,电泳得到的蛋白质条带几乎无明显差别;不同批次正品龟甲在一维电泳中显现出的蛋白亚基条带差异性很小,其电泳蛋白条带受产地、批次等因素影响较小;正品龟甲在14~19 kDa,有3条高丰度蛋白聚合在一起,这“二细一粗三聚合”的条带群,可以作为鉴别正品龟甲和其他龟甲混伪品的初步依据。结论:结果显示,SDS-PAGE电泳技术可以对龟甲及其混伪品药材进行初步的鉴别,利用蛋白条带的区别可对其进行区分。

非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨

目的:建立一种省时简便和灵敏可靠的检测筛查基因点突变的方法,即PCR-SSCP(PCR-Singlestrandconformationpolymorphism)银染分析技术。方法:应用改进的PCR-SSCP银染分析技术,检测妊娠期胆内胆汁淤积症患者外周血基因组DNA中MDR3基因外显子14的点突变情况。结果:非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳在有冷水循环装置控制下,结果稳定可靠,受环境温度影响小;但银染时,需根据室温调整染色时间及显影液的配制,当室温高于25℃时,碳酸钠需预冷,有利于控制背景色,得到更为满意的结果。结论:利用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法筛查目的基因的点突情况,具有省时简便和灵敏可靠的特点,且重复性好,避免了盲目测序及资金浪费。

浅析聚丙烯酰氨凝胶电泳实验中常见问题及解决方法

以四川省达州市主要农作物(水稻、玉米等)种子质量检测检验和园艺植物(果树、茶等)种质资源鉴定、性状分析时,基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的PCR扩增产物检测试验中存在的常见问题,探索可操作性的解决方法,以期为同行提供一些帮助和启示。

一种优化的双向凝胶电泳方法

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台 ,如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进一步深化研究的关键 .该文利用人永生化食管上皮细胞系SHEE为材料 ,采用IPG DALT系统双向凝胶电泳技术 ,通过对样品的制备及预处理、第一向等电聚焦、平衡和两向间的转移等关键步骤进行改进和优化 ,获得了高分辨率。

N-乙酰半胱氨酸防治内毒素所致肝损伤的实验研究

目的 探讨N 乙酰半胱氨酸 (NAC)可否对内毒素性肝损伤进行抑制及相应的细胞、分子机制。方法 健康雄性昆明种小鼠 30只随机分为肝损伤组、NAC组和对照组 ,不同给药后检测肝匀浆肿瘤坏死因子(TNF) α、丙二醛 (MDA)和还原型谷胱甘肽 (GSH)含量变化 ,并行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,分析NAC对核因子(NF) κBp6 5、IκBα的影响。 结果 NAC不但使肝组织TNF α、MDA含量降低 ,GSH含量升高 ,且抑制了内毒素诱导胞质IκBα降解和NF κBp6 5的表达。 结论 NAC可能通过调整库普弗细胞氧化还原平衡 ,影响NF κBp6 5活化 (核易位 ) ,从而抑制了TNF α等炎性因子基因的表达 ,减轻肝损伤。

大鼠锌指蛋白ZFP580的原核表达与分离纯化

【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。

平欧榛子蛋白分离及功能特性分析

为了充分利用平欧榛子资源，提高附加值，采用Osborne蛋白分级法及聚丙烯酰氨凝胶电泳提取并分析了其蛋白质组分和相对分子质量分布。采用碱溶酸沉法提取其分离蛋白并对分离蛋白的功能特性进行了检测和分析。结果表明：清蛋白占榛子粗蛋白的67．18％，球蛋白占17．62％，谷蛋白占6．53％，醇溶蛋白占3．17％；还原和非还原聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表明，榛子蛋白质各组分中均存在二硫键，非还原条件下，各组分亚基相对分子质量主要分布在35～71kDa，还原条件下，各组分亚基相对分子质量主要分布在16～50kDa且均有2条明显的亚基带；分离蛋白功能特性研究显示，pH值在等电点附近榛子蛋白的溶解性、持水性、起泡性和乳化性最低，而泡沫稳定性在等电点附近有最大值，50℃时持水性最高，而吸油性在50℃时最低为2．815g／g。

长白山区中国林蛙乳酸脱氢酶同工酶多态性的研究

用聚丙烯酰氨凝胶电泳对长白山中国林蛙的不同组织器官的乳酸脱氢酶的同工酶进行了分析 ,结果显示出最少为 7条酶带 ,最多为 12条酶带。并且各组织器官乳酸酶脱氢酶的活性和酶带数也各不相同。经分析 ,认为长白山区中国林蛙体内的乳酸脱氢酶同工酶是由三个基因控制的 ,即LDH -A、LDH -B、LDH -C ,其中LDH -A为单态基因 ,LDH -B和LDH -C为多态基因 ,LDH -B′与LDH -C′为其等位基因 ,这些基因在各组织器官中的表现程度不同 ,而呈现多态性 。

稻曲病菌AFLP反应体系的建立及其初步应用

本研究通过一系列梯度试验建立了最佳的稻曲病菌AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymor-phism)反应体系,并从256对EcoRⅠ和MseⅠ引物组合中选择30对条带清晰、多态性好的引物组合分析了2003年北京昌平基地的40个稻曲病菌株的遗传多样性。

羊乳酒在发酵过程中主要参数变化的研究

以新鲜羊奶为原料,采用乳酸菌和酵母菌共发酵方法,在29℃条件下振荡发酵羊乳,以pH值、酒精度、总氮及非蛋白氮含量为评价指标,通过凯氏定氮法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(SDS-PAGE),对羊乳酒在发酵过程的不同时期蛋白质降解的动态变化进行了研究。研究结果表明,羊乳酒在发酵的过程中的pH值呈现先降低后升高再降至稳定的趋势;酒精度呈现缓慢增长的趋势;总氮含量变化不大;非蛋白氮含量随着乳酒发酵的进行缓慢升高;SDS-PAGE结果显示,羊乳酒中蛋白质发生了不同程度的降解,小分子蛋白增多,蛋白分子质量主要分布在17~35 kDa。

罗氏沼虾变应原的热稳定性研究

目的分析罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)变应原和抗原的热稳定性。方法将罗氏沼虾变应原提取液在沸水中处理后,利用SDS-PAGE电泳技术和Western blotting技术分析处理前后提取液中抗原组分和变应原组分的变化。结果罗氏沼虾变应原提取液经SDS-PAGE电泳检测到11条可辨蛋白带,其分子量在35～105 kD之间。沸水处理以后,可辨蛋白带只有3条,其中44 kD的蛋白带为新出现的条带。罗氏沼虾变应原提取液经Western blotting检测到3条分子量均大于80 kD的致敏条带,而沸水处理后的提取液未检测到致敏带。结论罗氏沼虾变应原提取液经沸水处理以后,溶液中的变应原成分和其他蛋白成分发生明显变化。

精神分裂症循环免疫复合物M_r 187000蛋白质组分的鉴定及意义

目的探索精神分裂症循环免疫复合物(CIC)电泳图谱与正常人差异,并鉴定其差异成分。方法应用聚乙二醇6000沉淀法提取患者和正常人的CIC,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)鉴定目的条带。结果发现精神分裂症CIC电泳图谱有特异性条带与正常人有显著差异,其成分经鉴定为补体C3。结论精神分裂症与免疫系统密切相关,补体C3可能在其发生发展过程中发挥了某种作用。

白芷种子蛋白质提取方法的比较

[目的]建立适用于白芷种子的SDS-PAGE蛋白质样品提取方法。[方法]比较5种提取方法所获得白芷种子总蛋白质产量以及SDS-PAGE电泳的谱带数目、强度和电泳分辨率等方面的差异。[结果]方法 a所提蛋白质含量高,杂质少,电泳谱带清晰;方法 b所提蛋白质溶液电泳谱带清晰,分辨率较高,但提取含量较低;方法 c和d所提蛋白质杂质较多,纯度不高,分辨率较低;方法 e所提蛋白质纯度较高,但蛋白条带缺失较多。[结论]方法 a提取白芷种子蛋白质的效果最好,所提蛋白效率较高,杂质少,电泳谱带清晰,分辨率高,谱带数多,优于其他提取法。

食品加工中蛋白酶对乳清蛋白作用敏感性研究

研究了几种食品加工中常用的蛋白酶对乳清蛋白作用的影响,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳进行定量分析得出结论,通过酶类可以改变乳清蛋白的某些特性以满足食品加工中的特殊需求。

啤酒泡沫蛋白质的二级结构特点及其质谱鉴定

泡沫蛋白质对啤酒泡沫性能有重要影响。采用圆二色光谱技术研究啤酒泡沫蛋白质和麦芽蛋白质的二级结构构象特点,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D SDS-PAGE)与液质(LC-MS/MS)联用对啤酒泡沫蛋白质进行分离与鉴定。结果显示,麦芽蛋白质以α-螺旋结构为主,而啤酒泡沫蛋白质以β-折叠和无规则卷曲为主,并未表现出典型的α-螺旋双负峰特征,这种结构有利于泡沫蛋白质的疏水性,从而有利于啤酒泡沫的稳定性。经质谱检测,啤酒泡沫蛋白质中共鉴定出11种蛋白质,包括蛋白质Z4、LTP1、BDAI-1及部分酶抑制剂和少量醇溶蛋白片段。

四种芋艿蛋白组分的理化性质

以新鲜芋艿球茎为材料制备谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白4种蛋白组分,应用等电聚焦(IEF)、差示扫描量热仪(DSC)、氨基酸分析仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及圆二色谱(CD)等比较分析了4种芋艿蛋白成分的部分物化性质.结果显示:芋艿谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白的等电点分别为pH 6.76、6.67、5.23和5.04;4种主要蛋白组分分别含有3、3、2、2种不同相对分子质量的亚基,且亚基之间拟有二硫键的交联;4种蛋白组分的变性温度分别是71.2,71.9,70.1和67.1℃,其变性热焓分别为1.551,1.470,1.455和1.434 J/g;4种蛋白组分中的极性氨基酸分别是其蛋白含量的62.73%,64.3%,63.13%和61.62%,必需氨基酸分别是其蛋白含量的39.02%,28.20%,39.23%和38.47%;二级结构方面,清蛋白的α-螺旋含量最高,β-折叠含量最低;谷蛋白的β-折叠含量最高,α-螺旋含量最低.

鸡血清四种酶的分型研究

采用平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对鹿苑鸡、惠阳鸡、红波罗、明星鸡的血清酯酶(Es)、碱性磷酸酶(Akp)、淀粉酶(Amy)和亮氨酸氨胜酶进行了电泳分型。Es 可分出四种型,即 Es-A、Es-B、Es-AB 和 Es-O。Akp 可分为 F 型和 S 型。淀粉酶的第二条活性带有 Amy-2F(A),Amy-2S(B),Amy-Fs(AB)三种型。亮氨酸氨胜酶可分出两条区带,但未发现个体差异。

牛奶制品与植物蛋白制品中主要蛋白质组成的比较分析

为了给牛奶制品检测和消费者选择合适的蛋白产品提供科学依据,采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法对巴氏消毒牛奶、酸奶、奶粉和植物蛋白制品中的主要蛋白质成分进行了比较分析。结果表明:植物蛋白制品中的蛋白质成分主要分布在100～40ku之间,而牛奶制品的蛋白质成分主要分布在40ku以下。