乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２）及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统，供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞，并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液，用ＥＬＩＳＡ法测定ＳＥＡＰ活性及ＨＢｓＡｇ。结果在三种细胞中ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ均可表达，以７２小时表达的酶活性测定最为适宜；而ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ表达仅处于低水平。以ＳＥＡＰ表达量作为内参对ＨＢｓＡｇ的表达量进行比较，发现Ｓ基因１２９Ｌ变异体表达ＨＢｓＡｇ量显著高于野毒株。结论ＳＥＡＰ作为内参具有快速简便，不需同位素及特殊仪器的优点，有较高的实用价值。

SEAP的电流信号采集系统的设计及验证

短电弧加工(SEAP)是解决特硬、超强、高韧性等难加工材料的表层去除加工难题的有效手段。介绍了短电弧机床电流信号采集系统的结构组成和工作原理,对该系统进行了SEAP电流信号的采集以及电流波形变化规律的初步分析。另外,还介绍了该系统对采集的信号进行滤波处理的两种方法:数字滤波器滤波及小波变换滤波。

SEAP型人工膝关节置换的术后疗效——五年以上随访研究

目的：探讨ＳＥＡＰ型人工膝关节置换术（ＴＫＡ）的术后疗效。方法：采用ＳＩＣＯＴ／ＩＤＥＳ标准，对４５ 例（６５ 个关节）实施ＳＥＡＰ型ＴＫＡ患者进行随访、评估和统计学分析。随访时间为５２～８６ 个月（平均５ 年３ 个月）。结果：在能调查的２９ 例４３ 个关节中，疼痛膝占２３％ 。ＲＯＭ 均保持了手术时所改善的范围，而且术前有屈曲挛缩者也获得显著改善（Ｐ＜ ０．０１）。ＦＴＡ 及人工假体设置位置同手术时相比无明显改变。２ ｍ ｍ 以上ＲＬＺ的发生主要见于股骨髁后方和胫骨外侧。结论：ＳＥＡＰ型ＴＫＡ的中期疗效满意。

建立标准化SEAP报告基因系统的研究

通过建立SEAP(分泌性碱性磷酸酶)产物的标准曲线,得出SEAP的吸光值与酶活力、蛋白质绝对值之间相互换算的公式,从酶动力常数、酶反应时间、不同量mRNA与酶吸光值之间的对应关系等方面进行研究.建立了在405 nm波长处,SEAP的吸光值与酶活力之间、酶活力和蛋白质绝对值之间相互换算的两个公式:y(酶活力)=(x(吸光值)+0.002 8)/19.13×10;1U(酶活力)=5.035 ng(蛋白质绝对量),并在细胞和小鼠实验中得到了验证.建立了提高SEAP检测系统灵敏度的方法,并进行了导入目的基因不同方法的效率之间的比较.结果表明,建立的换算标准可以使SEAP报告基因系统从定性水平上升到定量水平,而且灵敏度可以达到10-18mol的标准.

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.

分泌型碱性磷酸酶报告基因重组载体pSEAP—IQCE3’UTR的构建

目的构建分泌型碱性磷酸酶（secretedalkalinephosphatasereportergene。SEAP）报告基因重组载体pSEAP—IQCE3’UTR，为鉴定FXR1P是否是通过与IQCE的3’UTR发生相互作用，进一步探索FXR1P的功能奠定基础。方法首先设计目的基因片段IQCE3’UTR的PCR引物，然后通过RT—PCR扩增加CE基因3’UTR基因片段，酶切扩增的片段和报告基因空载体，并将空载体去磷酸化，去磷酸化后的空载体与目的基因片段进行连接反应，将连接产物转化人大肠埃希菌JM109，最后筛选阳性克隆，PCR鉴定插入序列的正反。结果构建了分泌型碱性磷酸酶报告基因重组载体pSEAP—IQCE3’UTR，经酶切鉴定、正反鉴定和测序分析可知重组载体构建成功。结论成功构建了分泌型碱性磷酸酶报告基因重组载体pSEAP—IQCE3’UTR，为进一步探索FXR1P的功能及其在脆性X综合征中的发病机理有着重要的意义。

一种新型抗HCV药物筛选细胞模型建立的研究

目的构建HCV5’NCR调控外分泌性碱性磷酸酶(SEAP)基因表达的细胞模型。方法用PCR技术扩增HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2-Control的SEAP基因上游,构建HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株Huh-7。用化学发光法检测SEAP的表达,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸(ASODN)对SEAP表达的影响。结果重组质粒pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2-Control的78%,5μmol和10μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为31.2%和48.6%,而对pSEAP2-Control的SEAP表达无显著抑制作用(P>0.05)。结论重组质粒pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV5’NCR调控,为以HCV5’NCR为靶位点的药物筛选建立了检测方便的细胞模型。

以NF-_κB为靶的药物筛选方法的建立与应用研究

核转录因子-3B(NF-4B)通过调节其靶基因的表达,在机体免疫应答、炎症与肿瘤的发生发展过程中发挥着重要功能,因此也被认为是预防和治疗肿瘤与炎症的理想靶点.pNiFty-SEAP质粒被成功地转入HEK293细胞,因此该转染细胞含有5×NF-5B基序的增强子、SEAP报告基因和Zeocin抗生素抗性筛选基因.通过检测报告基因表达水平可反映NF-6B的活化状态.在以pNiFty-SEAP/HEK293细胞为基础建立的筛选体系中,TNF7和PMA等已知的NF-8B激活剂能剂量与时间依赖性地促进NF-9B的活化,而PDTC和NAC等NF-:B抑制剂的作用则相反.该筛选体系不仅具有稳定、特异、高通量等特点,而且可同时检测NF-;B的激活剂与抑制剂,将为发现作用于NF-<B信号传导通路的抗肿瘤与免疫调节药物提供有效的实验方法.

HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶基因在肝细胞中的表达

目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术 ,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株QSG770 1。用化学发光法检测SEAP的表达 ,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸 (ASODN)对SEAP表达的影响。结果 :重组质粒 pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2 Control的 76 %,5 μmol和 10 μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为2 9.2 %和 44 .6 %,而对 pSEAP2 Control的SEAP表达无显著抑制作用 (P >0 .0 5 )结论 :重组质粒 pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR调控 ,为以HCV 5′NCR为靶位点的药物评价建立了检测方便的细胞模型。

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的 建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法 构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果 ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论 本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。

GA_3和2，4─D对延缓蒜苔老化的效果

存贮过程中蒜苔细胞内含物快速向珠蒜转移，其水分和可溶性糖含量分别下降１３．６％和１７．５％，粗纤维含量相对提高１倍。ＧＡ＿３能有效地抑制上述转变，延缓老化。ＧＡ＿３与２，４－Ｄ配合使用效果更佳。封袋存贮虽有一定的保鲜效果，但室温下易导致腐烂。

人乳头状瘤假病毒中和抗体滴度和ELISA法测定的小鼠血清抗体滴度的相关性研究

目的探讨两种不同的报告基因纽扣珊瑚绿色荧光蛋白（Zoanthus sp．green fluorescent protein，ZsGreen）和分泌性碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）测量的人乳头状瘤假病毒中和滴度之间的相关性，以及中和滴度和抗体滴度的相关性。方法将密码子优化的人乳头状瘤病毒（HPV）衣壳蛋白L1、12基因表达质粒和报告基因质粒共转染293FT细胞，48h后收集细胞裂解上清，柱层析纯化假病毒，对假病毒滴度进行测定。采集免疫过候选HPV疫苗和Gardasil疫苗的小鼠血清，测量血清的中和滴度和抗体滴度。结果经统计分析，这两种报告基因系统的假病毒检测的中和滴度结果高度相关（Spearman相关系数r=0．760），而且中和滴度和抗体滴度的相关度很高（Spearman相关系数r=0．577和0．741）。结论两种不同的报告基因ZsGreen和SEAP测量的HPV假病毒中和滴度之间，以及中和滴度和ELISA测定的抗体滴度之间高度相关，揭示了部分HPV疫苗预防病毒入侵的机制，为快速准确鉴定HPV-16和HPV-18候选疫苗的免疫保护效果奠定了基础。