Nucleic Acid Aptamers as Potential Therapeutic and Diagnostic Agents for Lymphoma

Lymphomas are cancers that arise from white blood cells and usually present as solid tumors. Treatment of lymphoma often involves chemotherapy, and can also include radiotherapy and/or bone marrow transplantation. There is an unquestioned need for more effective therapies and diagnostic tool for lymphoma. Aptamers are single stranded DNA or RNA oligonucleotides whose three-dimensional structures are dictated by their sequences. The immense diversity in function and structure of nucleic acids enable numerous aptamers to be generated through an iterative in vitro selection technique known as Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Aptamers have several biochemical properties that make them attractive tools for use as potential diagnostic and pharmacologic agents. Isolated aptamers may directly inhibit the function of target proteins, or they can also be formulated for use as delivery agents for other therapeutic or imaging cargoes. More complex aptamer identification methods, using whole cancer cells (Cell-SELEX), may identify novel targets and aptamers to affect them. This review focuses on recent advances in the use of nucleic acid aptamers as diagnostic and therapeutic agents and as targeted delivery carriers that are relevant to lymphoma. Some representative examples are also discussed.

SELEX技术应用研究进展

SELEX技术是一项在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的新组合化学技术。其优点是筛选出的核酸适体易合成、易存储、易修饰等。该技术不仅在疾病(如艾滋病)的治疗及药物的开发等方面起着重要的作用,也为核酸和蛋白质结构及功能的研究提供了一种有效的方法。

Cell-SELEX技术研究进展

适配子是通过SELEX技术,即指数富集配体系统进化技术,经反复放大筛选得到的、与目标分子有高度亲和性的分子。SELEX技术常使用纯化的靶分子,目前活细胞也可用于筛选目标,这种技术称为细胞指数富集配体系统进化技术(CellSELEX),其优点是产生的适配子可以与活细胞中的靶分子的天然构象发生作用。细胞表面的跨膜蛋白也可作为适配子的目标。此外,在不知道任何细胞表面分子的情况下也可以得到细胞特异性适配子。对Cell-SELEX技术的应用及研究进展进行综述。

基于Cell⁃SELEX的核酸适配体在肿瘤诊治中的应用

细胞上的表面膜蛋白能够维持细胞结构的完整性以及调控细胞生理活动,膜蛋白种类及表达水平均与恶性肿瘤的发生发展密切相关。Cell⁃SELEX是将完整活细胞作为筛选靶标,其最大的优点是在筛选过程中能够同时以多种呈天然构象的膜蛋白为靶标分子,不需要预先了解细胞表面蛋白种类及其表达水平,特别适用于肿瘤细胞的核酸适配体筛选,为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来了新的思路和方法,在肿瘤诊治领域具有广泛的应用前景。本文对基于Cell⁃SELEX的核酸适配体在肿瘤诊治中的应用做一综述,以期对Cell⁃SELEX的研究提供参考依据,对恶性肿瘤的分子诊断、个体化治疗研究提供帮助。

SELEX技术及其在治疗领域应用的研究进展

SELEX技术由于适配子与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美,已被广泛应用于治疗领域的研究工作中,显示出良好的应用前景.目前涉及多种疾病治疗的适配子,包括感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、免疫系统疾病等已被筛选出来,并且疗效已经通过体外实验或动物模型得到证实.

基于Ser-SELEX技术的结肠癌血清适配体的筛选及其应用研究

目的为了解决癌症早期诊断困难的问题,实现结肠癌的早期检测。方法采用Ser-SELEX技术筛选了结肠癌血清的特异性适配体。通过前期结肠癌血清正筛-正常人血清反筛步骤和后期结肠癌血清正筛-其他癌症血清反筛步骤循环的方式,经过16轮筛选流程,共选取4条候选适配体,并对其进行序列分析、二级结构和三级结构模拟、特异性分析等。结果候选适配体主要形成的结构是茎环和假结两种,q PCR法测试亲和力,Kd约为10 nmol/L,适配体与结肠癌患者血清特异性结合情况分析表明,候选适配体APT-2具有良好特异性,且此种方法检出率约为82.5%。结论适配体(APT-2)应用于结肠癌早期诊断具有良好的发展前景。

核苷酸适体在靶向给药系统中的应用进展

适体,即体外合成筛选得到的能特异性地与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。由于其独特的性质,在靶向给药系统中有着广阔的应用前景,目前已成为靶向给药研究领域的热点。综述了适体在靶向给药系统中的优势及其应用进展,并对其应用前景和面临的问题进行分析。

复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展

核酸适配体是一类具有高度特异性和亲和力的单链寡核苷酸,被誉为"人工单抗",具有广阔的应用前景。它一般是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术筛选获得。目前SELEX技术多局限于单一、纯化的可溶性蛋白质靶标。然而,蛋白质的纯化过程繁琐,耗时费力,而且很多靶标(如血清中的低丰度蛋白质或细胞的膜蛋白)很难纯化获得单一纯品。复合靶SELEX技术则可以避免靶标的纯化过程,能够保持靶标的天然构象,并且可以在未明确靶标的组成及结构特性的前提下,通过高通量的盲筛获得一系列特异性核酸适配体。该文主要介绍以未纯化的各种生物样本为复合靶的SELEX技术,以期为核酸适配体的筛选提供新思路。

核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性(抗核酸酶降解能力)的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术(捕获-SELEX,Capture-SELEX)和均相筛选技术(氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX)。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件(文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度)和所获得的适配体的亲和力(KD,解离常数,dissociation constant)和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的KD和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。

核酸适配子在消化系疾病研究中的应用

核酸适配子是能特异性结合靶分子的单链寡核苷酸配体,通过指数富集的配体系统进化技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选得到.适配子的功能类似于抗体,但某些特性优于抗体,具有特异性高、亲和力强、靶标范围广、稳定性好、易于修饰、可人工合成等优点,在疾病的诊断和治疗中有良好的应用前景.在消化系统疾病中,适配子在肿瘤标志物、肿瘤治疗、丙型肝炎病毒、肝脏成像等领域的研究应用中已有报道.

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA 或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX 的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。

核酸适配子及其在阿尔茨海默病研究中的应用

核酸适配子是一类寡核苷酸分子,它可由指数级富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选寡核苷酸文库而获得。适配子通过与靶分子特异结合,可起到识别或抑制靶分子生物学活性的作用。近年来,越来越多的适配子不断被应用于阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的研究。本文将对近年来核酸适配子在阿尔茨海默病诊断和治疗的研究进展作一综述。

基于核酸适配体的肉制品中污染物检测技术研究进展

核酸适配体是经体外筛选技术得到的能够特异性结合靶物质的由十几个或几十个核苷酸组成的寡聚核苷酸片段。适配体分子质量较小、易于体外合成和修饰、化学稳定性好,且不依赖于生物体或细胞环境,具有空间结构多样和靶标分子广泛的特点,对包括金属离子、有机小分子、生物分子,甚至细胞和微生物在内的各类靶物质具有特异性识别作用,被誉为"化学抗体"。本文综述了核酸适配体的特点及其筛选方法,列举了核酸适配体在肉制品非法添加物、金属离子、病原微生物以及生物毒素检测中的应用,并对其应用前景进行了展望。

核酸适体及其在疫病诊断上的应用

核酸适体是指采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。鉴于适体特有的亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等特点,其被广泛应用于分析化学、基因调控、蛋白质组学和新药研发等领域。在疫病的检测方面,核酸适体逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已初步应用于生物芯片、生物传感器、分子信标等多种检测技术平台,并具有良好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本文就适体技术及其在疫病诊断中的应用进展作一综述。

肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定

目的筛选和鉴定肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体(Apt)。方法采用配体指数级富集系统进化(SELEX)技术,以DKK1为靶蛋白,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,从随机ssDNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适体。利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,表面等离子体共振仪分析测定核酸适体的亲和力。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库与DKK1靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第6轮筛选产物经PCR扩增进行高通量测序。表面等离子体共振仪检测结果表明,筛选得到的DKK1核酸适体与DKK1的结合解离常数均在纳摩尔级水平,Apt-5的Kd值最小,亲和力最高,Apt-26和Apt-28核酸适体亲和力相对较弱。二级结构预测分析表明,茎环和茎凸环结构为主要的结构形式。圆二色光谱分析结果显示,3个候选核酸适体(Apt-5,Apt-26,Apt-28)能特异形成G-四链体结构识别DKK1靶标蛋白。结论获得了与DKK1靶标蛋白特异性结合的核酸适体,为后续核酸适体的应用研究以及DKK1蛋白功能的研究奠定了基础。

HER-2核酸适配子的筛选及其对胃癌抗肿瘤活性的研究

目的应用SELEX技术筛选与HER2蛋白特异性结合的适配子（aptamer），探讨其对胃癌的抗肿瘤活性。方法（1）建立DNA寡核酸文库，通过SELEX技术筛选出HER-2核酸适配子，并行核酸适配子的鉴定及结构修饰。（2）采用胃癌细胞株的细胞增殖试验（MTT）及流式细胞术的细胞凋亡与增殖体外研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抑瘤活性。（3）建立Balb／C裸鼠胃癌模型，研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抗瘤活性。结果（1）筛选获得的胃癌细胞HER-2核酸适配子86个核苷酸序列，对NCI—N87蛋白裂解液中HER-2具有较好的亲和反应。（2）细胞增殖试验（MTS）显示HER-2适配子对NCI—N87细胞增殖活力具有显著的抑制作用，流式细胞术显示其能显著诱导NCI-N87细胞的凋亡。（3）体内胃癌模型实验显示HER-2核酸适配子能抑制肿瘤生长。结论采用sELEx技术筛选出高特异性及高亲和力结合HER-2的核酸适配子，通过体内外实验均证实HER-2核酸适配子可以抑制胃癌细胞生长、促进胃癌细胞凋亡而呈现良好的抗瘤活性。

血清淀粉样蛋白1特异性适配体的筛选

目的:筛选血清淀粉样蛋白1(SAA1)特异性核酸适配体。方法:利用磁珠指数富集的配体系统进化技术(Capture-SELEX)技术,靶标蛋白为SAA1,于单链DNA(ssDNA)文库中筛选与SAA1特异性结合的适配体,进行测序。软件分析适配体的一级和二级结构,酶标仪测定OD450值。结果:12轮筛选后,SAA1与ssDNA文库的亲和率由0.4%上升到21.7%;一级结构无同源序列,二级结构的茎环是SAA1与适配体结合的结构基础。结论:采用Capture-SELEX技术从ssDNA文库中筛选得到了SAA1核酸适配体,为预防和治疗感染性疾病提供一定的参考价值。

Aptamer-siRNA核酸复合物对人慢性粒细胞白血病(CML)小鼠模型凋亡信号转导的影响

SELEX技术筛选人慢性粒细胞白血病(CML)核酸适配子,合成aptamer-si RNA核酸复合物,观察aptamer-si RNA核酸复合物干预NOD/SCID小鼠慢性粒细胞白血病(CML)bcr-abl融合基因及P210、P53、TNF-α、bcl-xl相关因子表达水平。将K562细胞接种于全身照射后的裸鼠,待皮下成瘤后取出瘤块,制备成瘤细胞混悬液,再尾静脉接种于NOD/SCID小鼠,实验成功建立了全身播散型白血病模型,对实验小鼠行随机分组,以RT-PCR法检测aptamer-si RNA核酸复合物治疗小鼠体内bcr-abl融合基因表达水平,ELASA法检测小鼠P210、P53、TNF-α、bcl-xl表达水平。实验结果表明:Aptamer-si RNA核酸复合物可显著降低模型小鼠体内融合基因bcr-abl及融合蛋白P210表达水平,能提升P53表达,抑制TNF-α、bcl-xl过度表达,其抑制效果与aptamer-si RNA核酸复合物浓度有一定的相关性。aptamer-si RNA核酸复合物通过干预CMLbcr-abl融合基因及其表达的融合蛋白P210,影响细胞信号传导通路途径,有效阻断了CML传变的进展,揭示了aptamer-si RNA核酸复合物干预CML疾病的微观机理。