大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。

α-鹅膏[蕈]毒环肽核酸适配体的筛选和结构分析

α-鹅膏[蕈]毒环肽(α-amanitin)是从致命鹅膏毒伞子实体中分离的多肽物质。本文采用配体指数富集系统进化(systemic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以α-鹅膏[蕈]毒环肽为靶蛋白,以亲和填料epoxy-activated sepharose 6B为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其核酸适配体。经过12轮筛选,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的12条核酸适配体进行分析。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是核酸适配体与α-鹅膏[蕈]毒环肽特异性结合的基础。对得到的核酸适配体进行特异性和灵敏度检测,其中E06核酸适配体的特异性最好,为核酸适配体检测蘑菇中α-鹅膏[蕈]毒环肽的残留奠定了基础。

高特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ适配体的ePCR技术筛选及其表征

目的筛选出与心肌肌钙蛋白I(cTnI)具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,为诊断急性心肌梗死(AMI)提供实验基础。方法采用基于乳液PCR(ePCR)的SELEX技术筛选出能与cTnI特异性结合的3个适配体,并对ePCR条件进行优化,对适配体进行亲和力(Kd值)测定并与市售cTnI抗体进行比较,选出Kd值最小的适配体,进行特异性鉴定。结果SELEX过程中通过优化得到ePCR最佳条件,筛选得到的3个适配体均对cTnI具有较强的亲和力,其Kd值范围为2.04~16.85 nmol/L,其中适配体Apt-1的亲和力最强[Kd为(2.04±0.11)nmol/L]且优于市售抗体,特异性高,敏感性强,不与其他相关蛋白有非特异性结合。结论筛选出的适配体Apt-1能与cTnI产生高亲和力的特异性结合,可进一步用于临床样本中cTnI的检测。

真菌毒素适配体筛选技术研究进展

真菌毒素遍布于粮食生产、储藏、运输和加工等各个环节,其污染已经成为全球亟待解决的问题。对真菌毒素进行监测并配合使用各种有效的降毒手段,有助于真菌毒素污染问题的解决。目前,真菌毒素检测、监控和靶向降解所用识别元件多为抗体,但抗体存在价格昂贵、批次间差异性大、热稳定性差等缺点,限制了其应用,而适配体合成简单、热稳定性强、免疫原性小、几乎无批次间差异等优点,有望取代抗体,但目前有关适配体商业化应用仍旧很少。本文概括总结了以真菌毒素为靶标的适配体筛选技术及其所筛适配体情况,并分析了适配体商业化应用仍旧很少的原因,以及各种筛选技术所面临的问题和挑战,以期为真菌毒素适配体的筛选提供参考,促进粮食中真菌毒素污染问题的解决。

生物素-亲合素ELISA法对ANEPⅢ寡核苷酸适配子亲和力的定量测定

目的:定量分析SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选中寡核苷酸适配子的亲和力。方法:利用生物素和亲合素放大系统(BA-辣根过氧化物酶复合物系统)应用于ELISA的实验策略,对ANEPⅢ寡核苷酸适配子的亲合力进行测定。结果:确定BA-ELISA方法定量分析测定寡核苷酸适配子的基本实验步骤。结论:BA-ELISA法可以替代IFMA(免疫荧光测定试验)或放射性荧光标记方法进行寡核苷酸适配子的亲和力的定量测定。