SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用

目的筛选针对Orai1分子第1膜外区蛋白的核酸适配体,探讨适配体通过拮抗钙离子释放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)抑制肥大细胞活化的效应。方法构建随机单链DNA文库,利用不对称PCR对单链DNA文库进行扩增。采用聚苯乙烯酶联板为介质的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术筛选核酸适配体。利用酶联免疫吸附实验检测各轮筛选序列与靶蛋白的亲和力,验证适配体与靶蛋白的特异性结合;激光共聚焦显微镜观察适配体对细胞内钙离子浓度变化的影响;利用IgE介导的肥大细胞脱颗粒模型,观察适配体对β-氨基己糖苷酶释放的抑制效应。结果经过12轮SELEX筛选,获得了7条核酸适配体,其中AptamerY1解离常数(Kd值)为1.72×10-8mol/L。以终浓度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介导的人肥大细胞系LAD2钙离子内流,并对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95%。结论通过SELEX筛选,获得了7条针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体,所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制,进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放。

FluMag-SELEX技术体外筛选识别氯胺酮的DNA适体

目的利用FluMag-SELEX技术筛选出能特异性识别氯胺酮的DNA适体。方法体外合成78bp的随机ssDNA文库,氯胺酮作为靶分子,表面修饰甲苯磺酰基的磁珠作为固相载体筛选特异性识别氯胺酮的适体。经过13轮筛选后进行DNA克隆测序,并进行一、二级结构分析。通过对荧光强度的分析检测适体的亲和性、特异性和Kd值。结果获得2条ssDNA适体Apt#4和Apt#8,能够特异性地与靶分子氯胺酮结合,Kd值分别为0.59和0.66μmol/L。二级结构预测以茎环和G-四聚体为主,茎结构可能是适体结构稳定的基础,环和G-四聚体结构可能是与氯胺酮特异性结合的关键。结论 FluMag-SELEX技术可以较好地提高适体的筛选效率,得到能特异性识别氯胺酮的DNA适体,有望用于氯胺酮的快速检测。

人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析

目的:筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体。方法:采用配体指数级富集系统进化(systematic evolu-tion of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析。结果:经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析。一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础。根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力最高。结论:获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础。

SELEX技术的靶标范围拓展

靶标范围的不断拓展是指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术和其他随机文库技术(如噬菌体表面展示技术等)的显著特征之一。经过20多年的发展,SELEX的靶标已经拓展到包括金属离子、各种有机小分子、药物、蛋白质等生物大分子、致病微生物、活细胞和组织等在内的多种形式,以细胞和组织为靶标的SELEX筛选策略在肿瘤靶向诊断和治疗的研究中也得到了初步应用,本文综述了SELEX技术的靶标拓展情况。

建立基于适体-纳米金的比色生物传感器用于快速检测Lp-PLA2

目的筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的DNA适体, 并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体, 利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性, 并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物, 利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化, 分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度, 建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5, 解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L;并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法, 其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml, 反应时间30 min, 可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。

基于cell-SELEX的肿瘤核酸适配体筛选及其在肿瘤诊疗中的应用

核酸适配体以其高特异性和高亲和力在肿瘤的早期诊断、治疗等领域显现出巨大潜能，运用cellSELEX筛选获得的核酸适配体能够通过靶分子变化识别肿瘤细胞，进而实现肿瘤的预防与治疗。目前研究者们利用cell-SELEX技术并结合流式细胞术成功筛选到多条核酸适配体。弥补适配子缺陷并发挥其优势，可使核酸适配体技术真正应用于临床诊断与治疗。

肠致病性大肠埃希菌比色检测的适配体生物传感器研究

目的 结合纳米技术,构建一种可以快速比色检测肠致病性大肠埃希菌的适配体生物传感器.方法 对已有的适配体序列进行截短设计,将截短后的适配体通过酰胺化反应修饰到PDA纳米囊泡的表面,实现生物传感器的组装.利用适配体与LPS间特异性结合和结合后引起PDA纳米囊泡的颜色变化和比色响应值（CR）改变来定性或定量检测溶液中的肠致病性大肠埃希菌.并通过透射电子显微镜对PDA 纳米囊泡与肠致病性大肠埃希菌之间的作用进行验证.结果 成功获得具有结合肠致病性大肠埃希菌功能的适配体截短序列;成功构建可以快速比色检测肠致病性大肠埃希菌的适配体生物传感器,并经透射电镜证实.其不需要特殊仪器,操作简便,检测时间短,仅需30 min;灵敏度较高,检出限为105 CFU/ml,线性范围为105～108CFU/ml;稳定性高,对106 CFU/ml菌液检测的相对标准偏差为6.08%;特异性强,对肠致病性大肠杆菌0111的检测的特异性为100%.结论 本研究成功构建了肠致病性大肠埃希菌适配体生物传感器,实现对肠致病性大肠埃希菌的快速比色检测.

核酸适体和胶体金检测皮质醇含量的方法与应用

目的通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术获得皮质醇特异性核酸适体,应用核酸适体和胶体金建立一种灵敏的定量检测皮质醇含量的方法。方法采用柠檬酸钠还原法和硼氢化钠还原法制备胶体金,用核酸适体、胶体金聚集显色法检测皮质醇含量。结果相比20 nm胶体金,采用5 nm和13 nm胶体金颗粒具有较好的灵敏度、重复性和线性范围,5 nm胶体金颗粒用于皮质醇的检测的线性范围为10.1～320μmol/L,标准曲线相关系数r为0.9993,其重复性较好,标准差小于平均值10%。结论本实验建立了一种高灵敏性的能特异性地检测皮质醇标准品含量的方法。

适配子技术在自身免疫性疾病研究中的应用

适配子是能通过特定三维结构与多种靶标紧密结合的寡核苷酸或肽。由于具有亲和力高，特异性好，分子量小，免疫原性低，结构稳定，易合成等优点，适配子替代传统抗体，在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。现对适配子技术在自身免疫性疾病的诊断、治疗和致病机制研究中的应用现状及进展进行阐述。（中华捡验医学杂志，2012，35：212．215）

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将适配子库克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0，将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1，采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线，确定最佳阳性判定值，并构建散点图。结果经12轮筛选后，随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析，吸光度值为0．492—1．243，73．3％的适配子的吸光度值在1．0以上；二级结构分析显示，适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对；“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗（BCG）株]和阳性组（结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株）共47个菌株培养上清的检测结果显示，在临界（cut-off）值为0．61时，H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性，BCG株为阴性；阴性组标本的阴性检出率为85．7％，阳性组标本的阳性检出率为87．9％，表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。

SELEX筛选中不同筛选介质的富集效果比较

目的:比较SELEX筛选中不同筛选介质的富集效果,为高通量筛选奠定基础。方法:以乙肝表面抗原(HBsAg)为靶蛋白,采用两种不同的筛选介质:硝酸纤维素膜和环氧树脂,分别将HBsAg包被其上,利用SELEX技术从随机单链DNA文库中筛选得到富集的亲和配基库,最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和实时荧光定量PCR检测各自的富集效果。结果:经过16轮筛选,发现实时荧光定量PCR时,硝酸纤维素膜空白管与阳性管的循环阈值均在14循环,无明显区别;而环氧树脂空白管与阳性管的循环阈值区别明显,前者是25循环,后者是18循环。结论:在SELEX筛选中,以环氧树脂为筛选介质更易富集到与靶蛋白特异性结合的核酸适配体。

特异性结合白色念珠菌（1，3）-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的筛选及其应用

目的通过指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX）筛选能与高亲和力（1，3）-β-D-葡聚糖特异性结合的适配子，并用该适配子建立双适配子夹心酶联寡聚核苷酸吸附试验（enzyme-linked oligonucleotide assay, ELONA）来对深部真菌感染血浆进行辅助诊断。方法提取白色念珠菌ATCC10231株细胞壁（1，3）-β-D-肛葡聚糖，通过SELEX筛选获得能与（1，3）-βD-葡聚糖特异性结合的高亲和力单链DNA适配子，并用该适配子建立双适配子夹心ELONA来检测深部真菌感染血浆中的（1，3）-β-D-葡聚糖。结果从白色念珠菌细胞壁中成功提取了高聚合度（1，3）-β-D-葡聚糖，并通过体外酶解获得可溶性低聚合度（1，3）-β-D-葡聚糖作为筛选靶标。用SELEX进行12轮筛选后，从初始单链DNA文库中获得2个高亲和力适配子Au1和AD1，检测发现它们并非结合于（1，3）-β-D-葡聚糖的同一表位。双适配子夹心ELONA检测深部真菌感染血浆中（1，3）-β-D-葡聚糖的特异性和敏感度分别为91．94％和92．31％。结论从初始单链DNA文库中成功获得可与（1，3）-β-D-葡聚糖特异结合的高亲和力适配子，为深部真菌感染新型诊断试剂的研发奠定了基础。

病理类型特异的卵巢癌组织适配子的鉴定

目的鉴定经组织切片消减SELEX筛选获得的4条候选适配子对不同类型卵巢癌组织的识别特性。方法公司合成、荧光素修饰候选适配子,利用免疫荧光实验对筛选获得的适配子候选序列进行鉴定。结果免疫荧光实验证明,适配子OC-10-19和OC-10-36能够特异识别卵巢浆液性乳头状囊腺癌,且OC-10-36还能够对早期的不典型增生进行识别,另2条适配子OC-10-10和OC-10-37仅识别个别的卵巢浆液性囊腺癌。结论成功筛选获得识别不同类型卵巢癌组织的特异适配子,为适配子用于不同病理类型标志物的鉴定、临床辅助诊断等提供了理论基础。

适配子在肿瘤干细胞研究中的应用

肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在肿瘤生成、转移、复发和放化疗抗性等方面起着重要作用，是近年来肿瘤研究的热点。适配子是小分子寡核苷酸，具有极强的靶向性和亲和力，是肿瘤诊断和治疗的新型核酸分子。目前利用适配子进行肿瘤干细胞的诊断和治疗的研究越来越多，为肿瘤的诊断和治疗提供新的研究工具。