Sep15及其基因多态性的研究

Sep15是1998年发现的一种人硒蛋白,由于其分子质量为15 ku而被命名为硒蛋白15(Sep15)。迄今为止,Sep15的生物学功能还不十分明确,但是Sep15可能与肿瘤的发生有关。Sep15 cDNA序列分析揭示在其3'-UTR存在2个单核苷酸多态性位点:811(C/T)和1125(G/A)。这2个突变位点可能会影响硒依赖性Sec插入元件的功能,并最终与特定疾病的危险性相关。

人Sep15的基因克隆和功能的初步研究

背景与目的:Sep15是1998年发现的一种新的硒蛋白。文献报道Sep15可能与肿瘤的发生有关,并参与二硫键的还原。但迄今为止,Sep15的确切功能还不清楚。本实验拟对Sep15与肿瘤的关系及其抗氧化功能进行初步研究。方法:应用RT-PCR方法获得人Sep15的全长cDNA基因,并重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,将重组质粒pcDNA3.1-Sep15转染到人肝癌细胞株BEL-7402,得到Sep15高表达的细胞株BEL-7402-Sep15,然后通过一系列体内和体外实验研究Sep15与肝癌细胞的关系及其抗氧化作用。结果:转染Sep15基因不影响肝癌细胞株BEL-7402的细胞形态、生长速率、克隆形成能力和裸鼠体内肿瘤生长速率;检测不同浓度外源性H2O2氧应激处理后3种细胞BEL-7402-Sep15、BEL-7402-pcDNA3.1和BEL-7402的细胞存活率,结果显示BEL-7402-Sep15的细胞存活率明显高于BEL-7402-pcDNA3.1和BEL-7402(P<0.05)。结论:转染Sep15基因的肝癌细胞株BEL-7402具有抗氧化的生物学活性。

miR-155-5p靶向SEP15基因在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤中的作用

目的探讨miR-155-5p靶向SEP15基因对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤的影响及潜在机制。方法用含100μmol·L^-1 H2O2的培养液培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3建立H2O2损伤模型,根据处理和转染情况分为对照组、H2O2组、H2O2+anti-miR-NC组、H2O2+anti-miR-155-5p组、H2O2+pcDNA组、H2O2+pcDNA-SEP15组、miR-NC组、miR-155-5p组、H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC组、H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15组,Real-time PCR检测HLE-B3细胞中miR-155-5p和SEP15 mRNA的表达,Western blot测定SEP15、Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白的表达,ELISA测定H2O2诱导后HLE-B3中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平,流式细胞术测定细胞凋亡率,Targetscan预测miR-155-5p与SEP15的结合关系,双荧光素酶检测验证miR-155-5p与SEP15的调控关系。结果H2O2组HLE-B3细胞中miR-155-5p、SEP15 mRNA、SEP15蛋白、MDA、SOD、GSH-Px含量及凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H2O2+anti-miR-155-5p组和H2O2+anti-pcDNA-SEP15组的细胞凋亡率分别为(12.69±1.28)%和(14.67±1.52)%,分别与H2O2+anti-miR-NC组的(25.68±2.34)%和H2O2+pcDNA组的(23.65±2.17)%相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Targetscan预测miR-155-5p与SEP15存在结合位点,双荧光素酶检测结果显示,miR-155-5p组野生型WT-SEP-15的萤火虫荧光素酶相对活性为0.39±0.03,较miR-NC组的1.02±0.09显著降低(P=0.000)。与H2O2+anti-miR-155-5p-si-NC组相比,H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15组的SEP-15蛋白、Bcl-2蛋白、SOD活性和GSP-Px含量均显著降低,Bax蛋白、MDA含量及细胞凋亡率均显著升高(均为P<0.05)。结论miR-155-5p通过靶向SEP15基因以减轻H2O2对人晶状体上皮细胞HLE-B3的损伤并抑制细胞凋亡。

硒蛋白Sep15基因克隆、定点突变及其原核表达

克隆鉴定猪硒蛋白Sep15基因(Sep15),将其突变实现原核表达,为以猪为模型研究Sep15功能奠定基础。实验以RT-PCR从猪脾总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1230 bp的Sep15cDNA,3'-非翻译区Sec插入元件为2型,489 bp的ORF及对应氨基酸序列与人相应序列的相似度分别为85.1%和92.7%,ORF含一个硒代半胱氨酸(Sec)密码子TGA,定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGC后,经载体pET30转入大肠杆菌BL21(DE3),0.4 mmol/L IPTG诱导表达3 h获得融合表达产物;该产物在Western blot检测中与人Sep15 Sec下游肽段的商品化多抗产生特异性免疫印迹。猪Sep15被首次成功克隆并鉴定,其Cys突变体的原核表达产物与人Sep15 C-端抗体存在交叉免疫反应。