硒蛋白PP1(SEPP1)过表达抑制786-O和769-P人肾癌细胞增殖并引起G2/M期阻滞

目的构建硒蛋白PP1(SEPP1)基因的慢病毒质粒并研究SEPP1对人肾透明细胞癌细胞增殖的影响。方法以HEK293T细胞的c DNA为模板,通过PCR法获得人SEPP1全长序列片段,并与慢病毒表达载体p LV-EGFP(2A)Puro质粒相连接,获得重组p LV-EGFP(2A)Puro-SEPP1载体并进行基因测序验证。将重组慢病毒载体与包装质粒共同转染HEK293T细胞,进行病毒包装。用病毒上清感染786-O和769-P细胞,采用Western blot法检测SEPP1蛋白表达。按照重组慢病毒感染细胞、空载体感染细胞、未感染细胞进行分组,通过MTS法检测细胞增殖活性、细胞平板克隆形成实验检测克隆形成能力、流式细胞术检测细胞周期。结果酶切后凝胶电泳得到与SEPP1的DNA大小相一致的片段与空载体片段,基因测序的结果与SEPP1序列完全一致。经p LV-EGFP(2A)Puro-SEPP1感染的786-O、769-P细胞在感染48 h后,荧光显微镜下可见EGFP明显表达,实验组与空载体组、空白对照组相比较,SEPP1蛋白表达水平均明显提高。p LV-EGFP(2A)Puro-SEPP1感染组的细胞增殖能力降低,SEPP1过表达细胞集落形成能力明显降低,SEPP1过表达引起肾癌细胞G2/M期阻滞。结论在786-O和769-P细胞过表达SEPP1显著降低细胞增殖能力,并在786-O细胞中引起G2/M期阻滞。

预知子籽提取物抑制HepG2肝癌细胞增殖作用及对SEPP1等分子表达的影响

目的:观察中药预知子籽乙醇提取物(ATKS)对HepG2肝癌细胞增殖及对SEPP1等分子表达的影响。方法:将不同浓度ATKS作用于HepG2细胞24h、48h、72h,MTT法检测HepG2细胞的细胞存活率;相差倒置显微镜下观察药物作用72h后的细胞形态;RT-qPCR方法检测SEPP1等6个基因表达量的变化;Western Blot方法检测SEPP1蛋白水平变化。结果:ATKS作用后,HepG2细胞增殖被抑制,并存在量效和时效关系,其中72h细胞半数抑制浓度为2.0mg/ml;较低浓度对细胞形态影响较小,随着浓度增加细胞数量逐渐减少,2.4 mg/ml以上细胞数量锐减,状态变差,药物细胞毒作用凸显;2.0 mg/ml作用72h后,SEPP1基因表达被显著下调,其上游基因CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1、ITGB5却一致上调;SEPP1蛋白表达量也出现显著下降。结论:ATKS能抑制HepG2肝癌细胞增殖,并具有量效和时效关系;SEPP1等基因和蛋白表达量发生变化,可能与ATKS的抑制作用有关。

SEPP1基因与肿瘤研究进展

综述近10多年硒蛋白P(SEPP1)基因与肿瘤的研究进展,主要从血SEPP1蛋白水平与肿瘤发病风险的相关性、血DNA中SEPP1基因多态性与肿瘤遗传易感性、组织中SEPP1基因或蛋白表达变化及机制等三方面进行归纳。首先,血SEPP1蛋白水平低,推测与肿瘤慢性应激条件下肝脏及相关组织该基因表达受到抑制有关,但血SEPP1蛋白主要来源于肝脏分泌,与肿瘤组织本身直接关系并不大;其次,多种肿瘤发生后,SEPP1基因单核苷酸多态性(SNP)多见,可能会在一定程度上使其表达受限,从而与血中蛋白水平变化呈现一致性,这可能属于非特异性改变,但同时也能反映部分基因易感人群特征。再次,肿瘤组织中SEPP1基因或蛋白表达以下降居多,机制多围绕抗氧化展开,但部分机制仍待阐明。此外在后续研究中,可尝试关注SEPP1与免疫、肿瘤细胞的侵袭和转移等诸方面。

鸡Sepp1基因及其蛋白理化性质和分子结构的生物信息学分析

硒是人和动物生命必需的微量元素,硒的生物学功能是通过硒蛋白来实现的,硒蛋白P(Selenoprotein P,Sepp1)是机体含量最多的硒蛋白。利用生物信息学相关分析软件和比较基因组学的方法,对鸡Sepp1基因序列和氨基酸序列进行理化性质和结构特征进行分析和预测,并与猪、人、鼠、羊、狗等物种进行比较。结果显示,鸡Sepp1的CDS序列和编码的蛋白质与禽类动物相似,但和哺乳类动物之间差别较大;Sepp1的功能特性与硒半胱氨酸含量有关,不同物种Sepp1中硒半胱氨酸含量存在着差异;鸡Sepp1蛋白在第170-200位氨基酸残基区域具有特定理化性质和分子结构,推测该序列可作为调控鸡Sepp1功能的靶位点。研究结果为以后深入研究鸡Sepp1的机体功能、开发富集Se的动物功能性食品提供理论参考。

低氧诱导大鼠内脏脂肪组织炎症状态对SePP1的影响

目的:既往研究显示SePP1具有一定的抗氧化作用,而随着年龄的增加机体逐步出现一个慢性低氧、炎症状态,我们通过4%O2浓度体外培养大鼠脂肪前体细胞模拟其体内的低氧状态,进而观察常氧(21%O2)及低氧(4%O2)状态下大鼠脂肪前体细胞中炎症因子(IL-6,MCP-1,SePP1)水平的变化及不同状态下硒蛋白SePP1水平的变化。方法:取6-8周SD大鼠肾周脂肪前体细胞,分别于常氧(21%O2)及低氧(4%O2)状态下进行体外培养,诱导分化后采用油红O染色进行鉴定,至第三代后,分别采用PCR及Western Blot技术检测两种状态下脂肪前体细胞中IL-6,MCP-1,SePP1基因及蛋白表达的不同变化,同时观察不同氧浓度对脂肪前体细胞增殖的影响。结果:4%氧浓度状态下培养的脂肪前体细胞中IL-6,MCP-1的基因及蛋白表达均明显高于正常氧浓度下的脂肪前体细胞,而SePP1的基因及蛋白表达均下降,且低氧状态下脂肪前体细胞增殖较常氧状态下加快。结论:低氧培养可进一步使机体内脏脂肪组织堆积加重,造成脂肪前体细胞的炎症状态,并且可导致SePP1的表达下降,而SePP1具有一定的抗氧化作用,与机体动脉粥样硬化等心血管疾病的发生、发展有一定的关联,本实验结论为通过干预体内SePP1的水平为靶点治疗动脉粥样硬化提供了一定的实验依据,为进一步研究SePP1在低氧状态下对动脉粥样硬化的影响及作用机制提供了一定的试验基础。

猪硒蛋白P基因克隆、鉴定及组织mRNA相对表达量分析

本试验旨在克隆、鉴定猪硒蛋白P基因(Sepp1),并探明其在猪不同组织中的mRNA相对表达量,为以猪为模型研究硒蛋白P(Sel P)的功能奠定基础。根据表达序列标签(EST)序列设计引物,利用c DNA末端快速克隆(3'-RACE)技术从猪肝脏总RNA中扩增出含开放阅读框(ORF)至poly A片段,然后与EST序列进行拼接;采用荧光定量PCR技术考察Sepp1在猪9个组织中的mRNA相对表达量。结果显示:1)扩增出共1 707 bp的片段,测序后与EST拼接获得了2 109 bp的猪Sepp1序列,并提交至NCBI Gen Bank数据库,序列号为EF113596.2;该基因1 170 bp的ORF编码区和对应的氨基酸残基与人相应序列分别有83.72%和75.64%序列同源性,其编码390个氨基酸,含有14个硒代半胱氨酸(Sec)残基,分别位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位。2)Sepp1 mRNA在猪组织中广泛分布,在肝脏中具有最高分布,依次为甲状腺>肾脏>睾丸>下丘脑>脾脏>垂体>心脏>肌肉。本试验成功克隆、鉴定了猪Sepp1,检测了其在猪不同组织中表达分布情况,为其进一步以猪为模型探讨其功能奠定了基础。

硒蛋白P水平与2型糖尿病和非酒精性脂肪肝关系的研究

目的:研究硒蛋白P水平与2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的关联性。方法:采用ELISA方法检测初发各100例2型糖尿病患者、非酒精性脂肪肝患者健康对照血清硒蛋白P水平;同时测定葡萄糖、脂肪等常规指标。结果:2型糖尿病患者血清硒蛋白P水平高于对照组(t=2. 775,P=0. 006),非酒精性脂肪肝患者血清硒蛋白P水平高于对照组(t=7. 156,P=1. 581^(-11))。结论:硒蛋白P水平与2型糖尿病和非酒精性脂肪肝可能存在关联性。