siRNA沉默胃癌SGC-7901细胞HO1基因的细胞系的建立及其生物学行为

目的构建HO1基因的真核干扰表达载体,评估其转染人胃癌细胞系SGC-7901细胞后对HO1基因的干扰效果及其功能。方法将外源性重组真核干扰表达载体HO1基因(pS/HO1)转染到人胃癌细胞系SGC-7901内,经G418筛选并建立siRNA表达载体稳定沉默胃癌SGC-7901细胞HO1基因的细胞系,分为SGC-7901-pS/HO1组,转染空质粒细胞(SGC-7901-pS)组和未处理细胞(SGC-7901)组;用实时荧光定量PCR和蛋白印迹验证HO1基因在各组细胞中的表达,并通过CCK-8和克隆形成实验分别观察HO1基因被干扰后细胞的生物学行为。结果与SGC-7901-pS组相比,SGC-7901-pS/HO1细胞中HO1基因蛋白表达明显减少,降低了5.58倍(0.321±0.051 vs 1.675±0.153,P<0.05);与对照组相比较,SGC-7901-pS/HO1实验组较SGC-7901-pS对照组细胞增殖数量明显减少(P<0.001);与转染pS空载体的SGC-7901-pS细胞对照组相比,SGC-7901-pS/HO1细胞的克隆形成明显减少,降低了3.45倍(8.32±1.142 vs 2.32±0.362,P<0.05)。结论 HO1基因真核siRNA表达载体筛选成功,为继续深入的研究HO1基因在胃癌中的功能提供了依据。

用SCGE法观察砷、氟、黄绿青霉素和T-2毒素引起的SGC-7901细胞基因组DNA损伤

目的 观察砷、氟、黄绿青霉素和 T-2毒素对 SGC-790 1细胞基因组 DNA的损伤作用及特点。方法 染毒剂量 10μmol/ L ,染毒后 4h应用单细胞凝胶电泳技术结合“彗星图像分析系统”检测 DNA损伤。结果 Na As O2 组尾长明显大于对照组 ;Na F组拖尾率显著高于对照组 ;CIT组总拖尾率、尾长和尾动量均高于对照组 ;而 T-2毒素组各指标均高于对照组。结论 Na As O2 、Na F、CIT和 T-2毒素均可引起 DNA损伤 ,但各有特点 ,说明它们引起

去泛素化酶ABRO1对李斯特菌感染单核巨噬细胞IL-1β释放的影响及其机制

目的观察去泛素化酶Abraxas兄弟蛋白(ABRO1)对李斯特菌(LM)感染的小鼠单核巨噬细胞J774A.1白细胞介素(IL)-1β释放的影响,并探讨相关机制。方法培养J774A.1细胞,分别感染有李斯特菌溶血素O(LLO)的野生型LM菌株(野生型组)、敲除LLO的hly基因缺失(Δhly)LM菌株(基因缺失组)及Δhly株回补hly基因的LM菌株(回补株组),采用Western blotting法检测ABRO1蛋白,ELISA法检测细胞培养液上清中的IL-1β。将J774A.1细胞分为NI组(未感染LM菌株)、WT组(感染WT LM菌株)与Δhly组(感染Δhly LM菌株),各组分别转染NC si RNA、ABRO1 si RNA,采用ELISA法检测细胞培养液上清中的IL-1β,采用Western blotting法检测炎症小体相关分子Caspase-1、p20(Caspase-1活化形式)、IL-1β、p17。结果随着感染时间延长,野生型组、回补株组ABRO1表达、IL-1β水平逐渐增高,在感染120 min达到最高、均高于基因缺失组(P均<0.05);基因缺失组不同时点ABRO1表达、IL-1β水平无明显变化。WT组转染ABRO1 si RNA的细胞培养液上清中IL-1β水平及p20、p17表达低于转染NC si RNA的细胞(P均<0.05);WT组转染NC si RNA的细胞培养液上清中IL-1β水平及p20、p17表达高于NI组(P均<0.05);Δhly组转染NC si RNA的细胞培养液上清中IL-1β水平及p20、p17表达低于WT组(P均<0.05)。结论李斯特菌感染的J774A.1细胞中ABRO1表达增高,下调ABRO1表达后,J774A.1细胞中IL-1β释放减少;LLO可能通过激活炎症小体从而促进LM感染诱导的IL-1β释放。

曲古菌素A对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其DAPK1基因表达的影响

目的探讨曲古菌素A（TSA）体外抑制人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其DAPKl基因表达的影响。方法体外培养的胃癌细胞以不同浓度的TSA（37．5、150、600ng／ml）处理后，Annexin V／PI检测细胞凋亡率，RT—PCR、Western Blot分别检测DAPK1 mRNA和蛋白表达水平。结果不同浓度TSA可显著诱导SGC-7901细胞凋亡，并呈浓度及时间依赖性（P〈0．05），TSA干预前SGC-7901细胞DAPK1 mRNA和蛋白表达水平低，不同浓度TSA处理SGC-7901细胞后DAPK1 mRNA和蛋白表达水平明显上调，呈浓度及时问依赖性（P〈0．05）。结论TSA诱导SGC-7901细胞凋亡可能与DAPK1基因低乙酰化状态逆转有关。

砷剂诱导骨髓瘤细胞周期改变与SOCS-1基因去甲基化作用的研究

背景与目的:三氧化二砷(As2O3)在治疗多发性骨髓瘤中具有一定价值,有研究认为As2O3的治疗作用可能与诱导细胞内抑癌基因去甲基化作用相关。本研究旨在探讨体外As2O3诱导人骨髓瘤细胞周期改变与细胞内SOCS-1基因去甲基化之间可能存在的关系。方法:采用MTT法观察As2O3对骨髓瘤细胞U266、RPMI8226增殖情况的影响,流式细胞技术检测As2O3对骨髓瘤细胞周期的影响,甲基特异性PCR(MSP)法检测As2O3作用前后骨髓瘤细胞内SOCS-1基因甲基化状态的改变,实时PCR技术定量检测细胞用药前后SOCS-1基因mRNA的表达变化。结果:与对照组细胞相比,人骨髓瘤细胞U266、RPMI8226在较大剂量As2O3(0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L)作用72h后,细胞周期分布均发生G0/G1期阻滞,呈现G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞周期改变与As2O3剂量呈正相关(P均<0.05),骨髓瘤细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱(As2O30.5μmol/L作用72h后)或消失(As2O31.0μmol/L或2.0μmol/L作用72h后),SOCS-1基因在mRNA水平上表达明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:As2O3具有剂量依赖的诱导骨髓瘤细胞周期改变的作用,该作用可能与As2O3诱导SOCS-1基因去甲基化和SOCS-1基因再表达相关,这可能为进一步阐释As2O3治疗多发性骨髓瘤中的可能机制提供新的思路和方向。

非小细胞肺癌患者血浆 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO 基因甲基化状态观察

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2(3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因启动子区域的甲基化状态。方法采用甲基化特异PCR技术对63例NSCLC患者血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化进行观察,并以25例健康人作对照。结果 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%;健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%,而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出;两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比,P均<0.05。NSCLC患者血浆中上述5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。血浆甲基化RUNX3基因检出率与NSCLC的病理类型、临床分期以及分化程度有关(P均<0.05);甲基化RASSF1A基因检出率与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。结论 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

ATP1B1真核表达质粒的构建及其对胃腺癌SGC-7901细胞的作用

目的构建Na+,K+-ATP酶β1亚基(ATP1B1)真核表达质粒,为利用ATP1B1进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法以白细胞文库为模板扩增ATP1B1 cDNA,定向插入到pEGFP-C3真核表达质粒中,构建pEGFP-ATP1B1重组质粒;经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染胃腺癌SGC-7901细胞,利用real-time PCR检测转染后SGC-7901细胞的ATP1B1基因表达,并进行其ATP酶活性检测;MTT法测定转染后SGC-7901细胞的增殖活性。结果重组质粒经鉴定证实含有ATP1B1 cDNA序列,转染pEGFP-ATP1B1的SGC-7901细胞ATP1B1基因表达增高达129.2%,ATP酶活性增强为(2.95±0.210)%,细胞生长增殖显著受抑。结论成功构建了ATP1B1真核表达质粒,为进一步利用ATP1B1研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。

p21Cip1基因对V_(79-8)细胞周期的影响

为了探讨缺乏可测出Ｇ１、Ｇ２期Ｖ７９－８细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因ｐ２１Ｃｉｐ１的可表达重组质粒ｐＸＪＳＣ，转染该细胞系，建立了高表达ｐ２１的Ｖ７９－８－ＳＣ细胞。以３ＨＴｄＲ放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞Ｖ７９－８－ｎｅｏＧ１期明显延长，Ｇ２期也稍有增加。与此同时，Ｇ１期调控的ｃｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ４、Ｉｄ基因表达明显下降，Ｇ２期调控基因ｃｙｃｌｉｎＢ１的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于ｐ２１Ｃｉｐ１。

节律基因hClock及hBmal1对胃癌化疗敏感性的影响

目的:探讨节律基因hClock、hBmal1对胃癌细胞SGC-7901化疗敏感性的影响。方法:体外持续黑暗条件下培养SGC-7901,用实时定量PCR法检测两种主要的节律基因hClock、hBmal1在SGC-7901中不同时间点的表达,分别在节律基因hClock、hBmal1表达的高峰及低谷给予化疗药物多西他赛,CCK-8法检测化疗药物对肿瘤细胞的抑制率。结果:实时定量CR结果显示节律基因hClock、hBmal1在胃癌细胞SGC-7901中不同时间点表达不同,存在时相性波动,表达高峰在20:00,而表达低谷在08:00。CCK-8法显示在节律基因hClock、hBmal1表达高峰时,多西他赛对肿瘤细胞的抑制率低于其在低谷时的抑制率。结论:节律基因hClock、hBmal1过表达可以降低胃癌细胞SGC-7901对多西他赛的敏感性。

E1A基因对人宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的探讨E1A基因对人宫颈细胞化疗药物的增敏作用及其相关机制。方法E1A基因经PEI-Fe3O4纳米粒介导转染人宫颈癌细胞系,用不同浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇处理细胞,通过MTT法测绘细胞存活曲线,观察E1A基因对顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇等化疗药物敏感性的影响;用同一浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇处理细胞,观察E1A基因在不同时间对癌细胞存活率的影响。结果转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)对顺铂和紫杉醇的敏感性显著增加,与Hela和Hela-vect细胞系比较,Hela-E1A细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性分别提高了10倍和15倍;对5-氟尿嘧啶的增敏作用不明显。结论E1A基因能显著提高人宫颈癌细胞对顺铂和紫杉醇等化疗药物的敏感性。其作用机制可能是E1A基因抑制了该细胞的HER-2/neu基因的表达,使该细胞周期再分布,出现S期抑制和G2/M期阻滞。

E1A基因对裸鼠移植瘤细胞凋亡及Survivin、Caspase-3基因表达的影响

目的探讨E1A基因对裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡的影响及其相关作用机制。方法采用免疫组织化学染色检测E1A基因对裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡及Survivin基因和Caspase-3基因表达的影响。结果免疫组织化学染色显示:E1A基因组肿瘤细胞凋亡数量较多,Caspase-3基因呈高表达,Survivin基因表达较弱;而Hela和Hela-vect组肿瘤细胞凋亡数量较少,Survivin基因呈高表达,Caspase-3基因表达较弱。结论E1A基因能够明显促进裸鼠移植瘤肿瘤细胞的凋亡,该作用可能与E1A基因激活Caspase-3基因和抑制Survivin基因的表达有关。

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体,探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1,并将其转染NIH3T3细胞,采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达,检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1mRNA,细胞中的活性氧水平明显升高,同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1,使活性氧水平升高,并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。

沉默FOXO1抑制H_2O_2诱导的大鼠肺泡2型上皮细胞凋亡

目的探讨沉默叉头蛋白O1(FOXO1)基因表达对H_2O_2诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系(RLE-6TN)活力、凋亡的影响及机制。方法随机将RLE-6TN细胞分为对照组、H_2O_2组、si-FOXO1组和NC组。CCK8法及膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率;Western blot检测FOXO1、p53、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38)蛋白表达。结果 H_2O_2可明显上调RLE-6TN细胞FOXO1、p53、Bax和p-p38蛋白表达,抑制细胞活力,诱导细胞凋亡(P<0.05),而转染FOXO1 siRNA后可明显降低H_2O_2对FOXO1、p53、Bax和p-p38蛋白表达上调、细胞活力抑制及凋亡诱导作用(P<0.05)。结论沉默FOXO1基因表达可抑制H_2O_2诱导的RLE-6TN凋亡,其机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。

人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1 mRNA和蛋白表达水平及其意义

目的:探讨人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型(HepG2/IR)和逆转模型(HepG2/IRPH)中叉头状转录因子O1(FoxO1)的mRNA和蛋白表达水平,阐明该基因参与IR的作用机制。方法:选择人源肝癌HepG2细胞,采用终浓度1×10^(-10)、1×10^(-9)、1×10^(-8)、1×10^(-7)、1×10^(-6)和1×10^(-5) mol·L^(-1)胰岛素诱导24、48和72h,对照组细胞不加胰岛素,用葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖水平,计算各组细胞的葡萄糖消耗量,以确定IR模型建立的最佳诱导条件;采用终浓度为0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000mmol·L^(-1)盐酸吡咯列酮(PH)诱导HepG2建立逆转抵抗模型,同时设立对照组,MTT法检测细胞增殖活性,确定PH的最佳逆转浓度;利用Real-time PCR法和Western blotting法检测各组细胞FoxO1mRNA和蛋白表达水平。结果:1×10-7 mol·L^(-1)胰岛素作用36h,葡萄糖消耗量减少45.84%,发生明显的IR,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,1.25mmol·L^(-1)PH逆转抵抗24h,细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)。人源肝癌HepG2细胞发生IR时,与对照组比较,FoxO1mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01);IR模型逆转后,与对照组比较,FoxO1mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人源肝癌HepG2细胞IR与FoxO1mRNA的表达有关联性,FoxO1mRNA表达水平检测有可能作为胰岛素增敏剂的药效评估指标,降低FoxO1mRNA表达水平可作为2型糖尿病治疗的新靶点。

E1A基因对人宫颈癌细胞放射增敏的实验研究

目的探讨E1A基因对人宫颈癌细胞的放射增敏作用及其初步的作用机制。方法将人宫颈癌细胞(Hela)、转染空载体纳米粒的人宫颈癌细胞(Hela-vector)及转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)分别给以0、2、4、6和8Gy的6MV-X线照射,用集落形成法计算细胞存活分数及放射增敏比(SER),检测E1A基因对人宫颈癌细胞对放射线敏感性的影响;采用RT-PCR检测E1A基因的表达以及E1A基因对Her-2基因表达的影响,采用流式细胞术检测E1A基因对细胞周期的影响。结果集落形成实验结果显示:经不同剂量照射后Hela-E1A组平均细胞存活分数明显低于Hela和Hela-vector组,而后两组相近。Hela-E1A组D0值为1.23,Hela和Hela-vector组D0值分别为2.51和2.59,放射增敏比(SER)=(2.04);RT-PCR结果显示:E1A基因在Hela细胞中能稳定表达,E1A基因的转染明显降低了Her-2基因在Hela细胞中的表达水平;流式细胞术结果显示:转染E1A基因后,细胞周期出现S期抑制,G2期阻滞。结论E1A基因能够明显提高人宫颈癌细胞对放射线的敏感性,其作用机制可能与E1A基因抑制了该细胞Her-2基因的表达,使细胞周期再分布有关。

基因芯片分析NES1转染胃癌细胞株后肿瘤相关基因表达的变化

目的:探讨转染正常上皮细胞特异性-1基因(NES1)后,胃癌细胞株SGC-7901基因表达谱的改变。方法:应用脂质体介导的方法,将pcDNA3.1-NES1真核表达载体和peDNA3.1-vector分别转染胃癌细胞株SGC-7901,再分别提取转染peDNA3.1-NSES1和空载体peDNA3.1-vector的SGC-7901细胞总RNA。应用基因芯片技术分析NES1转染后基因表达的变化,并用实时定量PCR检验实验结果。结果:VES1转染胃癌细胞株后引起广泛的基因变化.其中上调及下调2倍以上的共有177个基因,这些基因的功能涉及多个方面,包括信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖及转移等结论:转染NES1基因后引起胃癌细胞SGC-7901基因广泛的表达变化,推测NES1的抑癌作用可能通过这些基因发挥,为进一步阐明NES1基因与胃癌发生、发展的关系提供了依据。

鱼藤素通过AKT/FoxO1信号通路诱导胃癌细胞凋亡的作用机制

目的:研究鱼藤素(De)诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡的其作用机制。方法:运用CCK-8细胞活力检测法考察不同浓度(10、20、40、60、80、100 mol/L)鱼藤素作用24、48 h对SGC-7901胃癌细胞的细胞毒性;将SGC-7901胃癌细胞分为对照组及20、40 mol/L鱼藤素药物组,给药作用24 h后,蛋白质印迹法检测p-AKT^(Thr308)、叉头框蛋白O1(FoxO1)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)等蛋白的表达水平;运用蛋白激酶B(AKT)基因转染使SGC-7901胃癌细胞中AKT过表达,然后给予20、40 mol/L鱼藤素给药作用24 h,以未用AKT基因转染的SGC-7901胃癌细胞作为对照组蛋白质印迹法检测p-AKT^(Thr308)、FoxO1、Bcl-2等蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果:不同浓度的鱼藤素对SGC-7901胃癌细胞均具有一定的细胞毒性;20、40 mol/L鱼藤素给药作用24 h能够显著降低SGC-7901胃癌细胞中p-AKT^(Thr308)、Bcl-2等蛋白的表达水平,升高FoxO1的表达水平;与对照组比较,AKT基因转染后,SGC-7901胃癌细胞中p-AKT^(Thr308)、Bcl-2等蛋白表达水平升高,FoxO1蛋白表达降低,与模型组比较,20、40 mol/L鱼藤素给药作用后能够降低p-AKT^(Thr308)、Bcl-2等蛋白的表达水平,降低Bcl-2 mRNA的表达水平,升高FoxO1及Bax的表达水平。结论:鱼藤素能够通过作用于AKT/FoxO1信号通路诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡。

E1A基因对人乳腺癌细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨

目的探讨E1A基因对人乳腺癌细胞化疗药物的增敏作用及相关机制。方法通过PEI-Fe3O4纳米粒介导将E1A基因导入人乳腺癌细胞系MCF-7,经G418筛选获得稳定表达E1A的转染细胞(MCF-7-E1A)。用不同浓度的表阿霉素、泰素帝及5-氟尿嘧啶等化疗药物处理细胞,通过MTT法测绘细胞存活曲线,观察E1A基因对表阿霉素、泰素帝、和5-氟尿嘧啶等化疗药物敏感性的影响;用同浓度的泰素帝和5-氟尿嘧啶处理细胞,观察E1A基因在不同时间对癌细胞存活率的影响。结果转染E1A基因的人乳腺癌细胞(MCF-7-E1A)对表阿霉素和泰素帝的敏感性显著增加,与MCF-7和MCF-7-vect细胞系比较,MCF-7-E1A细胞对表阿霉素和泰素帝的敏感性增加11倍和15倍;对5-氟尿嘧啶的增敏作用不明显。结论E1A基因能显著增加人乳腺癌细胞对表阿霉素和泰素帝等化疗药物的敏感性。

E1A基因对裸鼠移植瘤生长抑制及其初步作用机制的实验研究

目的:探讨E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其相关作用机制。方法:通过裸鼠移植瘤实验,观察E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的的抑制作用。采用免疫组织化学染色检测E1A基因对肿瘤细胞凋亡及Survivin基因和Caspase-3基因表达的影响。结果:裸鼠移植瘤实验结果显示:Hela-E1A细胞形成的肿瘤较Hela和Hela-vect的出瘤时间晚,生长慢,瘤重小,抑瘤率分别为83.42%和84.74%。免疫组织化学染色显示:E1A基因组细胞凋亡数量较Hela和Hela-vect组明显增多,Caspase-3基因(凋亡促进因子)呈高表达,Survivin基因(调亡抑制因子)的表达明显降低。结论:E1A基因能够明显抑制人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长,该作用可能与E1A基因激活Caspase-3基因和降低Survivin基因的表达有关。

口蹄疫病毒VP1基因C末端串连表达及其抗体ELISA方法的初步建立

口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的B细胞和T细胞抗原表位位于其C末端,参照Taiwanse97(AJ294928)设计了1对特异性引物,扩增出VP1基因C末端。序列分析表明:其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O/HKN/12/91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分别为95%、93%和96%、93%;利用同尾酶Xho 、Sal 将VP1基因C末端串连起来;再将单拷贝和双拷贝C末端基因插入到原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得表达,经Westernblot检测证实表达产物具有活性。以表达产物包被ELISA板,初步建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。同时用表达产物免疫Balb/c小鼠,能产生一定的抗O型口蹄疫病毒的抗体。