稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-突触核蛋白单克隆SH-SY5Y细胞株的建立

目的利用分子克隆技术构建含人野生型(WT)及致病突变A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重组真核表达载体pLentiVENUS-YFP-SNCA,通过慢病毒转染的方法获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein单克隆SH-SY5Y细胞株。方法提取红白血病细胞K562细胞总RNA,以RT-PCR法扩增SNCA,SNCA与克隆载体PMD-19T的体外连接(T-A克隆)后进行基因测序,将测序正确者以限制性内切酶酶切后与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立野生型重组真核表达载体。取正常SNCA与克隆载体连接体,利用单核苷酸差异引物定点突变法构建SNCA的两个突变型A30P、A53T,经基因测序、酶切与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立突变型的重组真核表达载体。以磷酸钙沉淀法转染293T细胞制备的慢病毒转染SH-SY5Y细胞,利用流式细胞仪BD AriaⅢ进行96孔板单细胞分选以获得稳定过表达人野生型及致病突变型A30P、A53Tα-突触核蛋白的单克隆细胞株,并通过倒置荧光显微镜、蛋白免疫印迹、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鉴定各单克隆SHSY5Y细胞株是否过表达。结果 Rt-PCR及电泳结果显示所获得目的基因,基因测序结果正确;重组真核表达载体pLentiVENUS-SNCA经限制性内切酶酶切和基因测序证明构建成功。倒置荧光显微镜显示除对照组(未转染组)外,空载体转染组及载体与SNCA重组后转染组均有荧光蛋白表达;但蛋白免疫印迹结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的蛋白含量高于空载体组。RT-PCR结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的细胞RNA表达量高于空载体组。结论利用分子克隆技术和慢病毒转染技术成功建立过表达α-突触核蛋白的WT及A53T、A30P突变型SH-SY5Y单克隆细胞株。

稳定表达野生型PINK1蛋白SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(AREP)PINK1基因真核表达载体,建立稳定表达PINK1蛋白的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增PINK1基因全长cDNA编码区序列,重组DNA技术定向插入真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)B,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,挑选出稳定转染的单克隆株,经提取gDNA进行PCR扩增、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表达。结果成功构建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表达载体,稳定转染SH-SY5Y细胞后,经提取gDNA扩增、RT-PCR及Westernblot检测到了野生型PINK1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达。结论构建了PINK1基因真核表达载体和稳定表达PINK1蛋白的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究PINK1基因功能及AREP发病机制提供了一个转基因细胞模型。

外源性Bax基因过表达对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株Smac蛋白表达的影响

目的观察Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因过表达对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞第二个线粒体来源的半胱氨酸酶的激活剂(Smac)蛋白表达的影响。方法采用脂质体Lipofectamine 2000将携带人Bax基因的过表达质粒转入SH-SY5Y细胞(转染组),同时设空载体组和未转染组。通过G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆。Hoechst33258染色观察凋亡细胞,免疫印迹法法检测细胞中Bax、Smac蛋白表达,免疫荧光染色检测Bax、Smac蛋白在细胞中的分布。结果转染后用G-418持续筛选2周可获得G418抗性的细胞克隆。Smac主要分布于胞质,Bax主要位于细胞核。转染组SH-SY5Y细胞Bax蛋白表达水平(1.067±0.036)较空载体组(0.436±0.035)和未转染组(0.444±0.046)显著增高(P<0.05);转染组Smac蛋白表达水平(1.408±0.044)相比空载体组(0.708±0.021)和未转染组(0.748±0.041)显著增高(P<0.05);空载体和未转染组细胞Bax和Snac蛋白表达均无显著差异(P>0.05)。转染组较未转染组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论外源性Bax基因转入人神经母细胞瘤细胞中并稳定过表达,能够上调Smac蛋白表达,促进细胞凋亡。

佛手多糖对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用研究

该文探究佛手多糖对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion,MPP+)诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用及其机制。佛手多糖经大孔吸附树脂AB-8进行纯化。体外培养SH-SY5Y细胞,构建帕金森病(Parkinson′s disease,PD)细胞模型,实验分为对照组、MPP+模型组、佛手多糖组。采用噻唑蓝(methye thiazdye telrazlium,MTT)法检测细胞存活率,Hoechst33258染色法观察细胞形态,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位,蛋白免疫印迹(Western blot)检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)和细胞色素c(cytochrome c,Cyt-c)蛋白表达水平。结果表明,佛手多糖的得率4.86%,纯度为44.46%,经过AB-8纯化后,纯度提高到60.81%;与对照组相比,模型组细胞的存活率显著降低,Hoechst33258染色下可见细胞破碎,细胞核皱缩,细胞内ROS显著增加,线粒体膜电位显著降低。与模型组相比,佛手多糖组的细胞存活率显著增加,细胞形态明显得到改善,ROS水平下降,线粒体膜电位升高。Western blot结果显示,佛手多糖能抑制MPP+引起的p-Akt和p-ERK1/2的降低,以及Cyt-c的上升。综上,佛手多糖对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过调节线粒体ROS的产生和Cyt-c的释放,进而维持线粒体稳态,激活Akt信号通路和ERK信号通路,抑制细胞的凋亡,从而起到保护作用。研究结果可为缓解帕金森病的发生发展提供理论依据,同时也能更好地开发和利用佛手资源。

老化黑碳颗粒诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y炎症反应及机制

以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象,分析被臭氧氧化的黑碳(oxidized black carbon,OBC)颗粒引起的炎症反应以及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号通路的作用.结果显示:随着OBC颗粒染毒质量浓度的增加(5、10、20、40µg/mL),细胞内线粒体跨膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平逐渐下降,DNA损伤程度逐渐升高,呈现质量浓度和时间依赖性;细胞外泌白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)水平升高和细胞内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因高表达,说明OBC颗粒会促进SH-SY5Y细胞发生炎症反应;细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因表达量升高,且HO-1蛋白水平升高,说明细胞发生氧化应激;胞内NF-κB和PI3K/Akt通路相关蛋白显著变化,表明OBC颗粒激活了NF-κB和PI3K/Akt信号通路.综上,OBC颗粒可诱导SH-SY5Y细胞发生氧化应激造成DNA损伤,促进炎症反应,且对NF-κB和PI3K/Akt信号通路有重要调控作用.

灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

背景:目前研究证实,灵孢多糖可促进神经退行性相关疾病的神经再生。神经退行性疾病的发生与线粒体功能失调密切相关,但灵孢多糖对神经退行性疾病的细胞凋亡及线粒体功能的调控作用尚不明确。目的:探索灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控作用及机制。方法:SH-SY5Y细胞分为3组:对照组,过氧化氢组,灵孢多糖组。对照组细胞正常培养,过氧化氢组细胞用300μmol/L过氧化氢处理24 h,灵孢多糖组先用300μg/μL灵孢多糖干预一两个小时,然后加入300μmol/L过氧化氢干预24 h,干预结束后用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,TUNEL染色试剂盒检测细胞凋亡情况,丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶活性,免疫荧光染色法和Western blot法检测凋亡、线粒体动力学相关蛋白的表达。结果与结论:①与对照组相比,过氧化氢组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著降低,细胞凋亡率、丙二醇水平显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著增高,细胞凋亡率、丙二醛水平显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);②与对照组相比,过氧化氢组促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加,差异均有显著性意义(P<0.05);③与对照组相比,过氧化氢组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著增高,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达显著降低,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);④以上结果证实,灵孢多糖可通过改善线粒体功能障碍以减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

不同浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y细胞的分化及凋亡

目的探讨不同浓度阿达帕林对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞形态学及功能的影响,以及诱导细胞分化及凋亡的作用。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、低浓度(0.1μM和1μM)阿达帕林组、高浓度(10μM)阿达帕林组。采用延时显微拍摄技术观察SH-SY5Y细胞形态学变化,采用免疫荧光染色法检测神经元特异性标志物β-微管蛋白Ⅲ和成熟神经元标志物神经丝重链多肽表达,采用多电极阵列记录SH-SY5Y细胞的电生理特征,细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。结果低浓度阿达帕林促进SH-SY5Y细胞突起形成,突起之间相互连接形成网络;低浓度阿达帕林处理SH-SY5Y细胞可见自发性放电活动。与对照组比较,1μM阿达帕林组SH-SY5Y细胞β-微管蛋白Ⅲ和神经丝重链多肽表达升高,高浓度阿达帕林组细胞凋亡水平升高(P<0.05)。结论低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟的功能性神经元,高浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞凋亡。

miR-181a靶向Bcl-2调控氧糖剥夺/再灌注模型诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡

目的皮层是响应脑缺血缺氧最为敏感的组织之一,基于前期深度测序技术,我们筛选获得响应脑缺血缺氧应激的皮层区目标基因miR-181a及Bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y细胞株氧糖剥夺/复糖复氧模型验证二者靶向调控关系及功能,明确miR-181a—Bcl-2调控网络在OGD/R诱导的神经细胞凋亡中的作用。方法采用线栓法构建大鼠缺血缺氧再灌注损伤模型,脑切片TTC染色及行为学评分法评估模型。应用qRT-PCR及Western Blot验证目标基因的表达。生物信息学分析miR-181a与Bcl-2的靶向结合位点并比对结合位点的保守性,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a与Bcl-2靶向结合的特异性。采用OGD/R细胞模型体外模拟脑缺血再灌注损伤,检测凋亡相关蛋白表达及Hoechst荧光染色评估细胞凋亡。结果大鼠大脑中动脉阻塞后miR-181a、Bcl-2表达变化趋势相反。RNA hybird软件预测miR-181a可结合Bcl-2的3′-UTR区,且结合区域高度保守。双荧光素酶报告基因实验发现,相对于Bcl-23′UTR-WT与mimic-NC共转染组,Bcl-23′UTR-WT与miR-181a mimic共转染后的荧光活性更低(P<0.001),而Bcl-2-Mut与miR-181a mimic共转染组,荧光活性无显著差异(P>0.05)。分别用miR-181a的模拟物及抑制物转染OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞,miR-181a可以抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平(P<0.001)。过表达miR-181a显著增加了SH-SY5Y细胞的凋亡(P<0.001),而抑制miR-181a表达可使SH-SY5Y细胞凋亡显著降低(P<0.001)。结论miR-181a可靶向结合Bcl-2,下调miR-181a可通过促进Bcl-2的表达进而抑制SH-SY5Y神经细胞OGD/R损伤诱导的细胞凋亡。

白藜芦醇对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用

目的研究白藜芦醇(Res)对H_(2)O_(2)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧化损伤的作用。方法选取一定剂量H_(2)O_(2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,通过检测Res对氧化损伤SH-SY5Y细胞的活力影响,筛选后续试验剂量。分别选取20,10,5,1μmol/L Res处理SH-SY5Y细胞24 h,加入1.2 mmol/L H_(2)O_(2),作用24 h,采用MTT法、生长曲线法测定细胞活力,流式细胞术测细胞周期,HE染色观察细胞形态,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量及细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果1.2 mmol/L的H_(2)O_(2)造成SH-SY5Y细胞氧化损伤,细胞活力降低,细胞周期改变,细胞形态变化,SOD和GSH-Px活力下降,细胞内MDA含量、细胞外LDH活力升高(P<0.01)。与模型组相比,20,10,5μmol/L Res组细胞活力升高,G_(0)/G_(1)期和G_(2)/M期细胞百分率显著升高,S期降低(P<0.01);细胞内SOD和GSH-Px活力上升(P<0.01),MDA含量、细胞外LDH活力明显降低(P<0.01)。结论20,10,5μmol/L Res对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤有一定的保护作用。

长链非编码RNA-SNHG15调控缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的研究

讨论长链非编码RNA-SNHG15如何调节SH-SY5Y细胞在缺糖缺氧损伤下的增殖和凋亡。方法 构建缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型,通过MTT和AnnexinV/PI等方法分析SNHG15对细胞增殖和凋亡的作用,从而明确SNHG15调控细胞的增殖和凋亡的分子机制。结果 缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型组SNHG15表达水平(4.48±0.12)明显高于常氧组(P<0.05);SiNC+OGD组(76.83±2.14)细胞的增值情况明显高于SiRNA+OGD组细胞(F=105.904;P=0.001),而细胞凋亡率则较之明显降低(F=2478.479;P=0.001),且细胞增殖结果为实验两组数据显著低于常氧组,细胞凋亡率结果为两组数据显著高于常氧组;与SiRNA+OGD组比较,SiNC+OGD组的细胞中Bax蛋白的表达显著减少,而Bcl-2和capase-3蛋白的表达则显著增加;与常氧组比较,两组细胞的Bcl-2、capase-3、Bax蛋白的表达均减少(F=80.146、P=0.001;F=3547.563、P=0.001;F=4164.163、P=0.001);P21在常氧组的表达明显低于其他组,SiRNA+OGD组中表达最高。结论 长链非编码RNA-SNHG15在调控缺糖缺氧损伤下的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡中发挥作用。在缺血性脑卒中的兴奋毒性中,P21的表达迅速上调,通过增强促凋亡蛋白Bax的表达,从而诱导caspase3介导的凋亡途径或直接破坏线粒体膜通透性。

川芎嗪对神经母细胞株SH-SY5Y细胞L型钙通道电流的影响

目的 研究川芎嗪对神经母细胞株 SH-SY5 Y细胞 L型钙通道的影响。方法 在 SH-SY5 Y细胞体外培养的基础上 ,采用全细胞膜片钳技术观察川芎嗪对 SH-SY5 Y细胞 L型钙电流 (ICa,L)的作用。结果 (1 )川芎嗪能够明显抑制峰值 ICa,L,且该作用具有浓度依赖性。(2 )川芎嗪使 ICa,L的 I-V曲线上移 ,但对其形状无明显影响 ,并且最大激活电位亦基本保持不变。结论 川芎嗪对 SH-SY5 Y细胞 L型钙通道具有明显的抑制作用。

玉米黄素对内质网应激引发的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的:研究玉米黄素对内质网应激引起的细胞凋亡的保护作用。试验分为空白对照组、衣霉素(TM)损伤组(5μg/mL)、玉米黄素保护组(5μmol/L)和损伤加保护组。采用Caspase 3试剂盒检测Caspase 3活性的变化;采用Western Blot法测定凋亡相关蛋白PERK、CHOP,PERK下游信号分子elF2α和ATF4,以及自噬相关蛋白Beclin 1。结果显示:与TM模型组相比,玉米黄素处理后PERK及其下游调控蛋白elF2α和ATF4的表达能力显著下降(P<0.01),Beclin 1的水平显著升高(P<0.01)。与未加自噬抑制剂相比,玉米黄素组的GRP78水平显著升高(P<0.01)。与对照组相比,TM模型组的CHOP蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01),而玉米黄素处理组CHOP蛋白的表达水平极显著低于TM模型组(P<0.01)。结论:玉米黄素能减轻由内质网应激引起的损伤作用,并且可逆转TM引起的损伤。其作用机制是:玉米黄素通过抑制PERK通路,进而抑制GRP78与ERS感受器的分离,降低促凋亡因子CHOP的水平,通过调控保护性自噬来缓解ERS。

川芎提取物通过miR-23a-3p/SNCA轴对帕金森综合征模型MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞的影响

目的探究川芎提取物对MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞和帕金森综合征的影响。方法1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP^(+))干预SH-SY5Y建立帕金森综合征细胞模型(SH-SY5Y-MPP^(+)),川芎提取物干预后检测细胞增殖、凋亡以及miR-23a-3p、SNCA的表达情况。另观察调控miR-23a-3p、SNCA表达后SH-SY5Y-MPP^(+)的变化,双荧光素报告酶验证miR-23a-3p与SNCA的关系。结果SH-SY5Y-MPP^(+)的细胞增殖能力明显低于SH-SY5Y,而凋亡率则高于SH-SY5Y(P<0.05)。川芎提取物干预下,SH-SY5Y-MPP^(+)的增殖能力、Bcl-2、SNCA蛋白升高,凋亡率与miR-23a-3p、Bax蛋白降低(P<0.05)。沉默miR-23a-3p与升高SNCA均可以促进SH-SY5Y-MPP^(+)的增殖能力,抑制凋亡;而升高miR-23a-3p与沉默SNCA则反之(P<0.05)。在线靶基因预测网站发现,miR-23a-3p与SNCA存在可结合的互补位点,双荧光素报告酶显示SNCA-wt的萤火活性在转染了miR-23a-3p模拟物序列后受到了明显的抑制(P<0.05)。在升高miR-23a-3p后,SH-SY5Y-MPP^(+)中SNCA蛋白表达降低,而沉默miR-23a-3p则反之(P<0.05)。拯救实验显示,川芎提取物对SH-SY5Y-MPP^(+)的干预效果被升高miR-23a-3p或沉默SNCA完全逆转(P>0.05);升高miR-23a-3p对SH-SY5Y-MPP^(+)产生的影响则升高SNCA逆转(P>0.05)。结论川芎提取物通过调控miR-23a-3p/SNCA轴影响MPP^(+)诱导的SH-SY5Y生物学行为改变,未来可能是治疗帕金森综合征的新方向。

抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

miR-155-5p靶向下调SOCS1减轻脂多糖诱导的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞炎症损伤

目的探讨微小RNA-155-5p(miR-155-5p)对脂多糖(LPS)诱导SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞神经炎症损伤的影响。方法采用人SH-SY5Y细胞,设立miR-155-5p过表达及其阴性对照(miR-155-5p mimic组、mimic-NC组)和miR-155-5p低表达及其阴性对照(miR-155-5p inhibitor组、inhibitor-NC组),将LPS处理上述各组转染成功细胞24 h,并设置未转染SH-SY5Y细胞的对照组和LPS处理组(LPS组)。噻唑蓝(MTT)法检测SH-SY5Y细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,反转录PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-10 mRNA水平和miR-155-5p表达,Western blot法检测细胞裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、磷酸化核因子κB p65/核因子κB p65(p-NF-κB p65/NF-κB p65)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK/p38 MAPK)蛋白水平。采用miR-155-5p模拟物(miR-155-5p mimic)、miR-155-5p抑制物(miR-155-5p inhibitor)调节SH-SY5Y细胞miR-155-5p表达,生物信息学预测miR-155-5p与细胞因子信号传送阻抑物1(SOCS1)靶向关系并进行荧光素酶实验验证。构建miR-155-5p与SOCS1均下调的SH-SY5Y细胞(miR-155-5p inhibitor/si-SOCS1组),采用上述方法检测细胞活性、细胞凋亡、炎性细胞因子mRNA表达以及SOCS1蛋白表达和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值。结果与对照组相比,LPS组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达降低,细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平升高,miR-155-5p表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值升高。与LPS组相比,miR-155-5p inhibitor组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达升高,miR-155-5p表达量、细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值降低。与LPS组相比,miR-155-5p mimic组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达降低,miR-155-5p表达量、细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值增加。miR-155-5p与SOCS1具有靶向关系,与miR-155-5p inhibitor组相比,miR-155-5p inhibitor/si-SOCS1组细胞活性、IL-10 mRNA水平降低,细胞凋亡率、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平升高。结论抑制miR-155-5p表达可减轻LPS诱导的神经炎症损伤,可能与靶向下调SOCS1表达有关。

活性氧对神经母细胞株SH-SY5Y细胞L型钙通道电流的影响

目的 探讨氧自由基导致神经元钙超载的发生机制。方法 在神经母细胞株 SH- SY5 Y细胞体外培养的基础上 ,采用全细胞膜片钳技术 ,观察 H2 O2 对 SH- SY5 Y细胞 L 型钙电流 (ICa,L)的影响。结果 (1) H2 O2 能够明显增加峰值 ICa,L,且该作用具有浓度依赖性。 (2 ) H2 O2 使 ICa,L的 I- V相关曲线下移 ,但对其形状和最大激活电位无明显影响。结论 H2 O2 对 L 型钙通道有明显的增强作用 ,此可能是其导致神经元钙超载的机制之一。

氟暴露下SH-SY5Y细胞ERK5信号转导通路的改变

目的检测ERK5信号通路中磷酸化的细胞外信号调节激酶5(P-ERK5)及P-ERK5在氟暴露下SH-SY5Y细胞中的表达,探讨ERK5信号通路与氟暴露下SH-SY5Y神经损伤机制的关系。方法用不同剂量氟化钠(NaF,0.000、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、1.000、2.000、3.000、4.000及5.000 mmol/L)处理SH-SY5Y细胞24 h及48 h,采用CCK8实验筛选出低和高剂量氟中毒浓度;再以正常组SH-SY5Y细胞为参照,用低、高剂量氟化钠剂量分别处理SH-SY5Y细胞24 h和48 h,采用实时荧光定量PCR检测处理48 h时各组细胞的ERK5 mRNA水平,用Western blot检测P-ERK5、ERK5蛋白表达水平。结果染氟处理后,0.500、1.000 mmol/L NaF处理SH-SY5Y细胞24 h及48 h细胞的存活率均低于正常对照组(P<0.05),可作为低剂量组和高剂量组的染氟剂量;染氟48 h时,对照组、低剂量组和高剂量组SH-SY5Y细胞中ERK5的mRNA表达水平分别为1.00±0.00、0.85±0.08、0.94±0.21,组间比较均无统计学意义。染氟24 h时,P-ERK5蛋白高氟组较低氟组和正常组表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),而染氟48 h时,染氟组P-ERK5蛋白表达升高,各组间比较均有统计学意义(P<0.05),染氟24 h和48 h正常组、低氟组、高氟组P-ERK5蛋白表达水平分别为(0.20±0.05、0.28±0.04、0.50±0.18)、(0.28±0.01、0.46±0.02、0.61±0.08);染氟24 h后,总ERK5蛋白升高,高氟组较低氟组、正常组有意义(F=14.731,P<0.05),而染氟48 h后,染氟组较正常组升高有统计学意义(F=17.877,P<0.05),染氟24 h和48 h总ERK蛋白表达水平分别为(0.34±0.04、0.36±0.05、0.67±0.12),(0.55±0.02、0.72±0.03、0.78±0.08)。结论ERK5信号通路中P-ERK5蛋白及ERK5蛋白在慢性氟中毒时被激活,随着染氟时间与染氟剂量增加其表达水平出现逐渐升高,其可能参与代偿性神经保护机制对抗氟的神经毒性作用。

稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论成功构建HSPA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。

去亚甲基小檗碱对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡的影响

目的探讨去亚甲基小檗碱(DMB)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。方法培养SH-SY5Y细胞,将其分为对照组、MPP+组、小檗碱(BBR,DMB的前体)+MPP+组、司莱吉兰(selegiline,与DMB同为单胺氧化酶B抑制剂)+MPP+组、DMB+MPP+组。应用免疫印迹法检测各组bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比,MPP+组bcl-2/bax比值明显降低(F=42.58,q=17.89,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理均可以抑制MPP+诱导的bcl-2/bax比值降低(q=6.71~10.63,P<0.001),且selegiline处理效果强于BBR和DMB(q=3.93、3.59,P<0.05)。与对照组相比,MPP+组cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(F=111.60,q=29.44,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理可以降低MPP+诱导的cleaved caspase-3蛋白表达上调(q=10.74~13.53,P<0.001),且3种药物处理效果差异无显著性。结论对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞,DMB可以升高bcl-2/bax比值,降低cleaved caspase-3蛋白的表达。

连翘苷对MPP^+诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的:研究连翘苷对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。方法:培养的SH-SY5Y细胞加入不同浓度的连翘苷,以MTT代谢率为指标确定连翘苷的无毒范围;对培养的SH-SY5Y细胞加入连翘苷100,10,1μmol.L-1预孵育24 h,加入1 mmol.L-1MPP+作用48 h诱导损伤,观察MTT代谢率、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)漏出率的改变。结果:连翘苷在1~100μmol.L-1浓度范围内不影响SH-SY5Y细胞存活率;与正常对照组细胞相比,MPP+损伤模型组MTT代谢率明显降低(P<0.001),LDH漏出率显著增加(P<0.001);与模型组相比,连翘苷各组细胞活性显著升高(P<0.05),LDH漏出率明显降低(P<0.01)。结论:连翘苷对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有神经保护作用。