中医药干预核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体防治类风湿性关节炎的研究进展

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、全身性自身免疫性疾病,以软骨损伤、滑膜炎症等为主要病理特征。核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体是一种细胞内感应蛋白复合物,可感知内源性危险信号并鉴别外来病原体,从而释放白细胞介素-1β、白细胞介素-18等促炎因子,介导细胞凋亡。研究表明,NLRP3炎症小体可以诱发炎症级联反应,加速软骨破坏,与RA密切相关。中医药在防治RA方面已取得一定成果。多项研究证实,中医药可靶向干预NLRP3炎症小体介导RA的病变过程,但尚未有系统性的相关论述。该文论述NLRP3炎症小体参与RA的机制,总结归纳近几年中医药干预NLRP3炎症小体防治RA的研究进展,以期为RA靶向药物的研发与应用提供一定借鉴。

SH3BGRL对胃癌细胞增殖、迁移的影响

目的探讨SH3结构域结合富含谷氨酸的蛋白质(SH3 binding glutamic acid-rich protein like,SH3BGRL)对胃癌细胞增殖、迁移能力的影响及其作用机制。方法基于TCGA、GTEx及GEO数据库,通过生物信息学分析SH3BGRL在胃癌组织及正常胃黏膜上皮组织中的表达情况;通过HPA数据库获取SH3BGRL蛋白在胃癌组织及正常胃黏膜上皮组织中的表达图谱;并基于TCGA数据库的SH3BGRL表达水平进行高、低表达分组,分析其对胃癌患者预后、免疫细胞浸润和免疫治疗的影响。通过临床标本IHC染色观察SH3BGRL蛋白在胃癌中的表达情况;采用RT-qPCR检测SH3BGRL在胃癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平。将胃癌HGC-27及NCI-N87细胞进行siRNA转染分为si-NC组(转染阴性对照组)、si-SH3BGRL组(沉默SH3BGRL组),并通过RT-qPCR及Western blot验证是否转染成功。采用CCK-8及Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力,随后诱导THP-1单核细胞分化为M0巨噬细胞,并将分化后的M0巨噬细胞和转染后的胃癌细胞进行共培养,采用RT-qPCR及细胞免疫荧光检测共培养之后M2巨噬细胞标志物的改变,并采用RT-qPCR检测SH3BGRL沉默胃癌细胞中CSF1的表达水平。结果生物信息学分析结果显示,与正常胃黏膜上皮组织相比,SH3BGRL在胃癌组织中表达上调(均P<0.01),且SH3BGRL高表达者总生存期和无进展生存期比SH3BGRL低表达的患者短(均P<0.01)。SH3BGRL高表达者M2巨噬细胞浸润比例更高,与免疫治疗低应答率相关(均P<0.01)。IHC染色结果表明,SH3BGRL蛋白在胃癌组织中表达上调(P<0.001)。与GES-1细胞相比,SH3BGRL在胃癌HGC-27及NCI-N87细胞中的mRNA表达水平均显著上调(均P<0.01)。与si-NC组相比,沉默SH3BGRL后HGC-27和NCI-N87细胞的增殖能力明显下降(均P<0.01),HGC-27细胞迁移能力显著下降(P<0.01)。M0巨噬细胞与沉默SH3BGRL的HGC-27及NCI-N87共培养后,M2巨噬细胞标志物CD163、CD206及Arg1均下调(均P<0.01)。在HGC-27及NCIN87细胞中沉默SH3BGRL后,NF-κB信号通路的靶基因CSF1显著下调(均P<0.01)。结论SH3BGRL在胃癌中表达上调,沉默SH3BGRL能抑制胃癌细胞增殖和迁移,其机制可能与抑制M2巨噬细胞极化进而形成免疫抑制肿瘤微环境有关。

相互作用结构域SH3和WW的蛋白质组学研究

在过去十年的研究中,发现许多蛋白质相互作用是通过相互作用结构域(如SH2,WW,SH3等)与其识别的另一个蛋白质中一段短肽序列的结合完成的,蛋白质相互作用结构域在蛋白质亚细胞定位、信号传导和蛋白复合体的组装等方面发挥重要功能。随着蛋白质组学技术的发展,高通量技术用于结构域结合特性及相互作用网络的研究。本文通过概述SH3和WW结构域的蛋白质组学研究策略的最新进展,总结结构域的几种现有研究策略。

微RNA-603靶向山梨糖和SH3结构域包含蛋白3诱导髓核细胞炎症反应影响椎间盘退行性变

目的筛选椎间盘退行性变(IDD)组织中表达升高的miRNA,探究其在IDD中的作用及可能机制。方法比较已发表的2个IDD miRNA表达谱测序数据集,筛选出表达升高最显著的miRNA——miRNA-603。收集10例IDD患者和10例腰椎骨折患者的椎间盘组织,取正常椎间盘组织分离培养髓核细胞。用qRT-PCR检测IDD组织和正常椎间盘组织中miRNA-603的表达。通过miRNA-603过表达和抑制实验探究miRNA-603在TNF-α诱导的髓核细胞炎症反应中的作用。利用生物信息学网站及已发表的IDD mRNA测序数据集,获得miRNA-603的靶基因山梨糖和SH3结构域包含蛋白3(SORBS3),并利用双荧光素酶报告基因实验验证。通过miRNA-603和SORBS3过表达实验探究miRNA-603和SORBS3在髓核细胞炎症反应中的功能。结果miRNA-603在IDD组织中表达升高(P<0.01)。在髓核细胞中过表达miRNA-603可以促进IL-6和IL-1β的表达(P均<0.01);抑制miRNA-603表达后,TNF-α刺激诱导的IL-6和IL-1β表达降低(P<0.01,P<0.05)。同时,cleaved caspase-1的蛋白表达量也降低(P<0.01)。生物信息学预测显示miRNA-603可以靶向调控SORBS3基因,IDD组织样本检测显示SORBS3低表达(P<0.01)。与单独过表达miRNA-603相比,同时过表达miRNA-603和SORBS3可抑制TNF-α诱导的髓核细胞中IL-6和IL-1β的表达(P均<0.01)。结论人IDD组织中miRNA-603表达升高。miRNA-603可能通过靶向抑制SORBS3继而诱导髓核细胞炎症反应,推动IDD进程。

锚蛋白重复序列3基因在早发性精神分裂症发生过程中的作用

目的探讨锚蛋白重复序列3(Ankyrin repeat 3,ANK3)基因在早发性精神分裂症发生过程中的作用。方法采用TaqMan探针等位基因分型技术检测310例早发性精神分裂症患者和399例健康对照ANK3基因rs10761482位点多态性,分析该位点与早发性精神分裂症的关联及其与发病年龄的关系,并调查患者母亲怀孕早期的环境因素,进一步分析ANK3基因与环境因素的交互作用。结果患者组与对照组ANK3基因rs10761482位点的基因型频率组间差异无统计学意义(x2=5.410,P=0.067),而患者组rs10761482 C等位基因频率高于对照组,有统计学意义(83.06%vs.78.07%,P=0.019);携带rs10761482 C等位基因患者发病年龄(13.7±0.1岁)明显早于不携带C等位基因患者发病年龄(16.1±0.3岁)(P=0.028);未发现ANK3基因与环境因素间之间存在交互作用(P>0.05)。结论 ANK3基因与早发性精神分裂症存在关联,其rs10761482多态位点可能是导致患者发病年龄提前的重要因素。

精神分裂症锚蛋白重复序列3基因多态性及表达研究

目的探讨锚蛋白重复序列3(ankyrin repeat 3,ANK3)基因多态性和基因表达与精神分裂症的关系。方法采用Taq Man探针等位基因分型技术对456例中国汉族精神分裂症患者(患者组)和495名正常对照者(对照组)ANK3基因多态性位点rs10994336、rs10994359进行基因分型,并对基因型、等位基因、单体型频率进行比较;然后采用Taq Man探针及实时荧光定量PCR方法检测另外30例急性期精神分裂症患者和26名正常对照外周血ANK3基因m RNA的表达水平。结果患者组与对照组rs10994336和rs10994359基因型、等位基因频率分布的差异无统计学意义(P>0.05)。单体型分析显示,由rs10994336-rs10994359组成单体型C-C、C-T、T-C的频率分布在患者组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,急性期精神分裂症患者外周血ANK3基因的m RNA表达水平略高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论本研究未发现ANK3基因位点rs10994336、rs10994359多态性与精神分裂症的关联,急性期精神分裂症患者外周血中ANK3基因的表达水平未见异常。

人源性基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术将人源性PLC-γ1中的SH2-SH2-SH3结构域基因扩增并克隆到载体pGEX-2T中,经热激反应转化到大肠杆菌BL21菌株内,在低温(33℃)下、利用IPTG诱导表达构建的重组基因的高效表达体系,利用谷胱甘肽琼脂糖(sepharose)4B纯化得到高表达的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测表明,PLC-γ1的SH2-SH2-SH3结构域重组基因可在低温(33℃)条件下在E.coliBL21细胞中稳定完整表达,但是在较高温度下(37℃)会产生SH2-SH2-SH3结构域不完全表达的现象。上述研究结果为人源性重组基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的深入研究和广泛应用奠定了基础。

血清miR-138-5p,SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度的相关性研究

目的探讨血清微小RNA-138-5p(miR-138-5p)、Sorbin和SH3结构域连接蛋白2(SORBS2)水平与老年冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者斑块稳定性及病变程度的相关性。方法取2022年7月至2024年1月于石家庄市人民医院收治的131例老年冠心病患者,根据超声结果确定血管腔内的斑块情况分为稳定组52例和不稳定组79例;根据冠状动脉造影结果进行Gensini评分,结合病变范围分为单支病变组42例,双支病变组46例和三支病变组43例。另外选取同期在本院进行体检的49例健康者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对两组血清miR-138-5p和SORBS2水平检测,采用Pearson法和Spearman法分析血清miR-138-5p和SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度相关性。结果不稳定组血清miR-138-5p低于稳定组、对照组,且稳定组低于对照组。不稳定组血清SORBS2高于稳定组和对照组,且稳定组高于对照组(P<0.05)。Pearson法分析结果显示,老年冠心病患者血清miR-138-5p水平与SORBS2水平呈负相关(P<0.05)。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清miR-138-5p水平是老年冠心病患者不稳定斑块形成的保护因素,三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清SORBS2水平是老年冠心病患者不稳定斑块形成的危险因素(P<0.05)。与单支病变组相比,双支病变组、三支病变组患者血清miR-138-5p水平降低,其中三支病变组降低更显著(P<0.05),血清SORBS2水平、Gensini评分升高,其中三支病变组升高更多(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,老年冠心病患者血清miR-138-5p水平与Gensini评分呈负相关,血清SORBS2水平与Gensini评分呈正相关。结论血清miR-138-5p和SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度密切相关。

NLRP3炎症小体在肺癌中的研究进展

核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3,NLRP3)炎症小体是重要的炎症反应调节因子,可诱导炎症级联反应,参与细胞凋亡。炎症与肿瘤发生发展存在某种关联。本文对NLRP3炎症小体的研究进展及其在肺癌发生发展和治疗方面的相关研究成果进行综述,旨在为肺癌的临床预后及治疗方案的选择提供一定参考。

干扰素α-1b联合人免疫球蛋白对EB病毒感染患儿临床疗效及对Ficolin-3、SH2D1A表达的影响

目的探讨人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗对EB病毒(EBV)感染患儿的临床疗效,并分析治疗对患儿免疫相关分子纤维胶凝蛋白3(Ficolin-3)、SH2结构域蛋白1A(SH2D1A)表达水平的影响。方法选取2018年2月至2020年2月在该院就诊的130例EBV感染患儿,根据治疗方式不同分为对照组和观察组,各65例。对照组给予常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗。观察两组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失时间。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测治疗前后两组EBV-DNA、EBV-CA-IgM及EBV-NA-IgG,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组治疗前后血清Ficolin-3、SH2D1A水平,以及外周血白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)。结果观察组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失或消退时间均短于对照组,EBV-DNA、EBV-CA-IgM转阴率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与治疗前比较,治疗后两组Ficolin-3、SH2D1A、IL-6、IL-8、TNF-α、CD8^(+)明显降低,CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前Ficolin-3、SH2D1A表达与IL-6、IL-8、TNF-α及CD8^(+)呈正相关(r=0.478、0.454、0.503,0.462、0.443、0.511,均P<0.001),与CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)呈负相关(r=-0.567、-0.402、-0.423,-0.477、-0.416、-0.409,均P<0.001)。观察组治疗总有效率[96.92%(63/65)]明显高于对照组[80.00%(52/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.119,P=0.003),并发症总发生率[9.23%(6/65)]明显低于对照组[30.77%(20/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.423,P=0.002)。结论干扰素α-1b联合人免疫球蛋白能降低EBV感染患儿Ficolin-3、SH2D1A水平,改善患儿免疫功能,提高治疗有效性。

白色念珠菌经组织蛋白酶B途径诱导小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体表达

目的探讨含热蛋白结构域3富含亮氨酸重复序列的核苷酸结合寡聚化结构域(NLRP3)在白色念珠菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用及其激活途径。方法体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,将其分为空白对照组、CA-074Me组、白色念珠菌组、白色念珠菌+10-6mol·L-1CA-074Me组和白色念珠菌+10-5mol·L-1CA-074Me组。实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞内NLRP3 mRNA表达,Western blot检测细胞内溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B)和胱天蛋白酶-1(caspase-1)p20蛋白质水平,酶联免疫吸附试验测定各组细胞培养上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果白色念珠菌组细胞内NLRP3 mRNA表达、cathepsin B和caspase-1 p20蛋白表达、细胞培养上清液中IL-1β水平均显著高于空白对照组(P<0.01)。加入10-5mol·L-1CA-074Me干预后,细胞内NLRP3mRNA表达、cathepsin B和caspase-1 p20蛋白的表达及细胞培养上清液中IL-1β水平与白色念珠菌组比较显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论白色念珠菌通过活化cathepsin B诱导巨噬细胞NLRP3的表达、caspase-1的活化和IL-1β的分泌。

lncRNA SH3BP5-AS1单核苷酸多态性与中国汉族人缺血性中风血瘀证显著相关

目的研究旨在探讨中国汉族人群中lncRNA SH3BP5-AS1多态性rs11713836与缺血性中风(ischemic stroke,IS)遗传易感性及中医证候的关系。方法研究包括774例IS患者和793例对照组。采用Massarray SNP基因分型方法进行基因分型。采用《中风病中医辨证诊断标准》量表对IS患者进行中医证候鉴定。所有统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行。结果在隐性模型下,lncRNA SH3BP5-AS1多态性rs11713836与缺血性中风血瘀证显著相关[OR(95%CI)=0.52(0.29-0.93),P=0.028],在校正了包括性别和年龄在内的协变量后,结果依然有统计学意义;而rs11713836与缺血性中风易感性及风、痰、火热、气虚证等中医证候易感性无相关性。此外,rs11713836与血清APO-B[隐性模型:OR(95%CI)=0.09(0.02-0.17),P=0.032]、VLDL[加性模型:OR(95%CI)=0.09(0.04-0.14),P<0.001;显性模型:OR(95%CI)=0.09(0.02-0.16),P=0.011;隐性模型:OR(95%CI)=0.19(0.09-0.30),P<0.001]、TG[加性模型:OR(95%CI)=0.15(0.05-0.24),P=0.003;显性模型:OR(95%CI)=0.14(0.01-0.27),P=0.041;隐性模型:OR(95%CI)=0.31(0.11-0.50),P=0.003]、FIB[显性模型:OR(95%CI)=0.20(0.04-0.35),P=0.012]显著相关,调整性别年龄后以上关联依然有统计学意义。结论lncRNA SH3BP5-AS1多态性rs11713836可能影响缺血性中风血瘀证的发生,有望作为缺血性中风血瘀证的生物标志物与潜在治疗靶点,并且可能影响缺血性中风患者的血脂代谢和凝血功能。

甲状腺癌组织中TIPE2、LASP1蛋白表达与其临床病理特征及预后的相关性分析

目的探讨甲状腺癌组织内人肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)、LIM和SH3结构域蛋白1(LASP1)表达与其临床病理特征及预后的相关性。方法回顾性分析81例甲状腺癌患者的临床资料。所有患者采用手术治疗,术中切除病理标本后,再切除距离肿瘤2 cm以上的正常组织作为癌旁标本,术后及时送检。采用免疫组化法检测TIPE2、LASP1表达,比较肿瘤标本及癌旁标本内TIPE2、LASP1表达差异;比较TIPE2、LASP1表达与其临床病理特征相关性及其预后的相关性。结果肿瘤标本内TIPE2阳性表达率低于癌旁标本,LASP1阳性表达率高于癌旁标本,差异有统计学意义(P<0.05);TIPE2表达阳性组Ⅰ~Ⅱ期、淋巴结无转移、肿瘤直径<2 cm占比高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05);LASP1表达阳性组Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、肿瘤直径≥2 cm占比高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05);随访3年,81例患者共31例出现复发转移,预后不良发生率为38.27%(31/81);TIPE2表达阳性组预后不良5例(17.24%),阴性组预后不良26例(50.00%);TIPE2阳性组预后不良率低于阴性组,差异有统计学意义(χ^(2)=8.457,P=0.004);LASP1表达阳性组预后不良率(45.00%)高于阴性组(19.05%),差异有统计学意义(χ^(2)=4.435,P=0.035)。结论甲状腺癌组织内TIPE2阳性表达率较低,LASP1阳性表达较高,TIPE2、LASP1表达与肿瘤分期、淋巴结转移及肿瘤直径关系密切,且TIPE2低表达、LASP1高表达患者预后较差。

MiR-223-3p通过靶向SORBS1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性

目的:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线治疗药物,CRC细胞对5-FU的耐药是导致化学治疗(以下简称“化疗”)失败的主要原因,然而耐药机制仍不明确。本研究旨在探究参与CRC细胞对5-FU耐药的抑癌基因,并寻找对该基因存在调控作用的微RNA(microRNA,miRNA)。方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载CRC数据集GSE28702和GSE69657,分别分析2个数据集中对FOLFOX化疗方案应答组和无应答组患者的差异表达基因并确定目标基因;采用在线生物信息学数据库TargetScan、miRwalk和miRDB预测靶向目标基因含山梨醇和SH3结构域蛋白1(sorbin and SH3 domain containing 1,SORBS1)的miRNA。采用瞬时转染技术在CRC细胞系HCT116、SW620中分别转染siSORBS1、HA-SORBS1、miR-223-3p mimic、anti-miR-223-3p及其相应的阴性对照(siNC、HA、miR-NC、anti-miR-NC),在HCT116细胞中共转染miR-NC和HA、miR-223-3p mimic和HA、miR-223-3p mimic和HA-SORBS1、anti-miR-NC和siNC、anti-miR-223-3p和siNC、anti-miR-223-3p和siSORBS1。采用实时反转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和/或蛋白质印迹法检测细胞中SORBS1和miR-223-3p的表达水平。转染后用不同浓度的5-FU处理细胞。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,双荧光素酶报告分析验证miR-223-3p与SORBS1的靶向关系。结果:GSE69657数据集和GSE28702数据集应答组分别有409和528个高表达基因,共有22个高表达交集基因。在22个高表达交集基因中,与CRC化疗敏感性有关的抑癌基因有3个,选择SORBS1作为目标基因进一步探索。3个在线生物信息学数据库预测的靶向SORBS1的miRNA为miR-223-3p。用5-FU(25μmol/L)处理HCT116、SW620细胞12~36 h后,2种细胞中miR-223-3p的表达水平均显著下调(均P<0.05)。转染siSORBS1或miR-223-3p mimic后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均下调,细胞活力均增加(均P<0.05);转染HA-SORBS1或antimiR-223-3p后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均上调,细胞活力均下降(均P<0.05)。双荧光素酶报告分析结果显示:共转染SORBS13'-非翻译区(untranslated region,UTR)野生型质粒和miR-223-3p mimic的细胞荧光素酶活性显著低于共转染SORBS13'-UTR野生型质粒和miR-NC的细胞(P<0.05)。与共转染miR-223-3p mimic和HA的细胞比较,共转染miR-223-3p mimic和HA-SORBS1的细胞活力明显降低(P<0.01);与共转染anti-miR-223-3p和siNC组比较,共转染anti-miR-223-3p和siSORBS1组细胞活力明显增加(P<0.05)。结论:MiR-223-3p通过靶向SORBS1基因增加CRC细胞对5-FU的耐药性,miR-223-3p有望成为临床治疗CRC的新靶点。

结构域蛋白质组学研究进展

蛋白质的结构域是蛋白质中具有特异结构和独立功能的区域。与蛋白质本身的数量相比 ,结构域的数量是有限 ,每个结构域所包含的成员数目也是有限的。在蛋白质组学研究的现阶段 ,研究方法上的限制尚无法全面实时地研究哺乳动物细胞的整个蛋白质组。由于结构域在功能上的重要性和其数量的有限性决定了以结构域为研究对象在蛋白质组学规模上进行研究不失为现阶段蛋白质组学研究的一种现实的选择。本文综述一些在这些方面所做出的早期的尝试。研究人员分别以SH3、PDZ和WW等结构域为对象进行蛋白质组学规模上的研究 ,并建立和完善了一些研究方法。总之 。

大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenes is abundant group3)蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量(13600)接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500mmol/LNaCl和1200mmol/L山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500mmol/LNaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌(BL21/pET28a)的存活率;在含1200mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.

SHIP1调控STAT3信号通路对白血病Jurkat细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP1)通过调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对人白血病细胞活力和凋亡的影响。方法:以白血病Jurkat细胞为研究对象,将转染空载体和SHIP1过表达载体的细胞分别记为阴性对照(NC)组和SHIP1组,同时以不作处理的细胞为空白对照(control)组,用real-time PCR和Western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白水平。同时,用STAT3信号通路抑制剂AG490作用于control组和SHIP1组细胞,分别记为control+AG490组和SHIP1+AG490组,再观测上述指标的变化。结果:分别与control组和NC组比较,SHIP1组SHIP1的mRNA表达水平和蛋白水平均显著升高(P<0.05);细胞存活率显著降低(P<0.05);细胞凋亡率显著升高(P<0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05)。分别与control组和control+AG490组比较,SHIP1+AG490组的细胞存活率显著降低(P<0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05);细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:SHIP1能够通过抑制STAT3信号通路抑制人白血病细胞生长,促进白血病细胞凋亡。

miR191调控SH3BP5对三阴性乳腺癌预后的影响

目的探讨微小RNA-191(miR191)调控SH3结构域结合蛋白5(SH3BP5)基因对三阴性乳腺癌患者预后的影响。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院2010年1月至2015年1月收治的216例手术切除并经病理学诊断的三阴性乳腺癌患者乳腺组织废弃标本和完整临床资料,选取健康女性(乳腺癌疑似患者活检后正常)正常乳腺组织样本5例作为对照。采用实时定量聚合酶链反应检测miR191、SH3BP5 mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测其蛋白表达,分析miR191、SH3BP5与三阴性乳腺癌患者预后的关系。采用蛋白质印迹法检测三阴性乳腺癌组织凋亡蛋白——PARP剪切体表达情况。结果三阴性乳腺癌组织miR191 mRNA表达(3.28±1.75)明显高于正常乳腺组织(0.73±0.32),SH3BP5 m RNA表达(0.79±0.24)明显低于正常乳腺组织(3.67±0.31),差异均有统计学意义(P<0.05);三阴性乳腺组织SH3BP5蛋白表达水平也明显低于正常乳腺组织。SH3BP5表达水平高的患者5年生存率[88.43%(191/216)]高于SH3BP5表达水平低者[50.46%(109/216)]。SH3BP5表达水平低的患者PARP剪切体表达升高。结论 miR191抑制SH3BP5表达是三阴性乳腺癌患者预后不良的标志。

蛋白磷酸酶C1-TEN在急性髓系白血病细胞中的表达及抑制FLT3-ITD对其表达的影响

目的:本研究旨在揭示急性髓系白血病(AML)细胞中具有C1结构域并与TENsin同源的蛋白磷酸酶(C1-TEN)的表达情况,并探讨中间串联重复突变FMS样酪氨酸激酶3(FLT3-ITD)抑制条件下C1-TEN的表达水平。方法:利用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)索拉菲尼、米朵妥林作用于AML细胞系HL-60细胞、MV4-11细胞,采用MTT实验评价AML细胞对TKI的敏感性;TKI对AML细胞FLT3活化作用及对C1-TEN表达的影响采用Western blot(WB)分析;CCK-8实验分析C1-TEN抑制对AML细胞活性的影响;WB、流式(FACS)检测细胞凋亡情况。结果:相比FLT3野生型(FLT3-WT)HL-60细胞,FLT3-ITD突变MV4-11细胞对TKI显著敏感(P<0.05)。WB结果显示,经TKI作用后MV4-11细胞的酪氨酸激酶FLT3活化较HL-60细胞显著下降(P<0.05)。与阴性对照组比较,TKI处理组MV4-11细胞C1-TEN表达显著下降,而HL-60细胞的变化不明显。C1-TEN抑制剂DHTS作用后,MV4-11细胞活性显著下降(P<0.05),且DHTS与TKI具有协同抑制作用。WB、FACS结果显示,DHTS处理组MV4-11细胞凋亡显著高于阴性对照,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究首次报道AML细胞C1-TEN表达情况,揭示FLT3-ITD能上调AML细胞C1-TEN表达,而抑制C1-TEN可通过细胞凋亡机制杀伤FLT3-ITD突变的AML细胞,因此提示该蛋白磷酸酶可能是FLT3-ITD下游分子,有望成为AML治疗的新靶点。

E3泛素连接酶RFWD家族成员在肿瘤中的作用研究进展

环指和WD重复结构域(RING Finger and WD Repeat Domain,RFWD)蛋白属于E3泛素连接酶,在细胞增殖、凋亡和DNA损伤修复的调控中发挥重要作用。越来越多的证据表明,RFWD蛋白通过靶向其底物泛素化降解参与肿瘤的发生发展。RFWD蛋白在不同类型的人类恶性肿瘤中具有抑癌和促癌的不同作用,可能与其底物蛋白的功能有关。本文分析了RFWD蛋白家族成员(RFWD1,RFWD2,RFWD3)的结构和功能,总结了RFWD蛋白家族成员的已知底物,并阐明其在不同肿瘤中的不同功能。此外,本文还讨论了RFWD家族成员作为癌症治疗潜在靶点的可能及策略。