外源性PTEN基因稳定转染对SHG44细胞周期和增殖的影响

以PTEN基因真核表达载体体外转染SHG44细胞 ,筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养 ,以原位杂交、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况 ,并研究了PTEN基因对胶质瘤细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响 ,观察导入人PTEN基因对SHG44细胞裸鼠致瘤能力的影响。结果表明 ,稳定转染PTEN基因的SHG44胶质瘤细胞中PTEN基因和蛋白均稳定表达 ,细胞周期明显改变 ,细胞从G1期到S期发生抑制 ,细胞超微结构有退行性改变 ,细胞增殖活性及裸鼠致瘤能力显著降低。提示转染外源性PTEN基因可阻止SHG44胶质瘤细胞由G1期进入S期 ,并抑制肿瘤细胞增殖。

冬凌草甲素诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡及其分子机制的研究

目的研究冬凌草甲素诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡及其分子机制。方法采用CCK-8比色法绘制生长曲线,冬凌草甲素分别以0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L观察对胶质瘤SHG44细胞生长活性的影响;Hoehst33258和TUNEL染色法观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;通过Western blotting分析凋亡相关蛋白Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2在胶质瘤SHG44细胞中蛋白的表达情况。结果冬凌草甲素作用胶质瘤SHG44细胞24 h和48 h后,细胞的增殖受到明显抑制,且24 h和48 h细胞半抑制率(IC50)的浓度分别是7.865和4.74μmol/L;Hoechst33258和TUNEL染色结果发现形态发生明显改变,出现了典型的细胞凋亡变化;Western blotting检测结果显示冬凌草甲素诱导后,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,并激活了凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达。结论冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用,同时调控凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。

缺氧诱导SHG44细胞拟态血管形成及相关机制

目的探索缺氧对Ⅱ-Ⅲ级人脑星形细胞瘤细胞血管生成拟态(VM)的诱导作用及其相关机制。方法应用化学缺氧法诱导人脑星形细胞瘤SHG44细胞(Ⅱ-Ⅲ级)在三维培养体系中形成血管生成拟态,采用Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力,用Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测血管内皮生长因子(VEGF)、酪氨酸蛋白激酶受体A2(EphA2)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9和血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)的表达,探讨缺氧诱导血管生成拟态的机制。结果在三维培养体系中,缺氧能诱导SHG44细胞相互连接,相互融合形成管状结构。缺氧组平均每视野管状结构数量为56.80±12.21,对照组为4.20±2.62,两组相比具有统计学差异(P<0.01)。缺氧组细胞侵袭数目为64.56±16.40,细胞迁移数目为178.71±18.81,明显高于对照组(P<0.01),与血管生成拟态的形成呈正相关。VEGF、EphA2、MMP2、MMP9的表达也明显增强,但是VE-cadherin的表达无明显改变。结论缺氧能够诱导SHG44细胞形成血管生成拟态,VEGF-EphA2-MMPs-VM可能是形成血管生成拟态的关键通路。

^(60)Coγ射线照射联合三氧化二砷对人脑胶质瘤SHG44细胞DNA损伤的研究

目的研究60Coγ射线照射联合As2O3对SHG44细胞的生长抑制作用。方法以SHG44细胞为实验对象,3H-TdR掺入法研究As2O3和照射对SHG44细胞DNA合成率的影响;用单细胞凝胶电泳法,以DNA彗星尾长及尾部DNA百分含量来比较As2O3、照射分别单独作用及它们联合作用对细胞DNA的损伤。结果联合组SHG44细胞存活率低于As2O3(P<0.01);3组均诱导DNA损伤,联合作用组对细胞DNA的损伤程度明显高于照射及As2O3单独作用组。结论电离辐射和As2O3联合应用对SHG44细胞的杀灭作用均强于电离辐射和As2O3单独作用。

三氧化二砷对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖的抑制作用

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法观察As2O3对SHG44细胞的增殖抑制率;激光共聚焦显微镜检测As2O3作用于SHG44细胞后细胞内活性氧自由基(ROS)水平变化。结果 As2O3对SHG44细胞增殖具有明显抑制作用,随着As2O3浓度的升高和作用时间的延长,细胞的增殖抑制率升高,12μmol·L-1As2O3对SHG44细胞增殖的抑制率可达63.8%;As2O3可以明显提高SHG44细胞内ROS水平,其ROS水平随As2O3作用浓度的增高明显增高,具有浓度依赖关系。结论 As2O3能明显抑制SHG44细胞的增殖,抑制作用呈现剂量依赖性和时间依赖性,其机制与升高细胞内活性氧水平有关。

凋亡抑制基因survivin真核表达载体的构建及其在SHG44细胞中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白基因survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并观察其在人胶质瘤细胞系SHG44中的表达.方法:利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增SVV基因编码序列,扩增产物双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,成功构建SVV基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV.通过脂质体介导用pcDNA3.1-SVV转染SHG44细胞,经G418筛选,RT-PCR、免疫蛋白印迹(Western Blot)和免疫细胞化学方法鉴定SVV的表达.结果:经酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实成功构建了SVV基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV.蛋白和RNA水平检测表明SVV基因在SHG44细胞中稳定表达.结论:真核表达载体pcD-NA3.1-SVV使SVV基因在SHG44细胞中稳定表达.

DOX-PBCA-NP的制备及其对脑胶质瘤SHG44细胞的抑制作用观察

目的制备阿霉素(DOX)-聚氢基丙烯酸丁酯(PBCA)-纳米粒(NP),观察其在体外对脑胶质瘤SHG44细胞的抑制作用。方法采用乳化聚合法制备DOX-PBCA-NP,透射电镜观察其形态,紫外分光光度法测定其载药量和包封率。将SHG44细胞加入不同浓度的DOX-PBCA-NP进行培养,流式细胞仪(FCM)测定细胞凋亡和细胞周期,倒置显微镜观察细胞生长情况。结果DOX-PBCA-NP呈圆形,载药量与包封率分别为10.58%与87.43%。在同一DOX浓度的DOX组、DOX-PBCA-NP组与对照组相比,G1/G0期SHG44细胞增多、S期细胞减少(P<0.01),DOX-PBCA-NP组的变化较DOX组更明显(P<0.05)。结论用乳化聚合法制备的DOX-PBCA-NP形态一致,具有较高的载药量和包封率,体外对脑胶质瘤SHG44细胞的抑制作用较DOX增强。

人参皂苷Rh2下调Wnt/β-catenin信号通路调控SHG44细胞的增殖和凋亡

目的研究人参皂苷Rh2(GS-Rh2)下调Wnt/β-catenin信号通路调控SHG44细胞的增殖和凋亡。方法体外培养SHG44细胞,以5、10、20、40、80μg/m L的GS-Rh2作用24 h和48 h,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞凋亡情况,RT-PCR检测细胞Wnt-1,β-catenin m RNA表达的变化,Western blot检测GS-Rh2对SHG44细胞Wnt-1、β-catenin蛋白表达的变化。结果与空白对照组比较,5、10、20、40、80μg/m L GS-Rh2作用24 h和48 h时,SHG44细胞增殖抑制率依次升高(P<0.05),SHG44细胞总凋亡率依次增大(P<0.05);与空白对照组比较,5、10、20、40、80μg/m L GS-Rh2作用24 h和48 h时,SHG44细胞Wnt-1、β-catenin m RNA和蛋白水平依次降低(P<0.05)。结论 GS-Rh2具有一定的抗肿瘤活性,可抑制SHG44细胞增殖、诱导其凋亡,且具有剂量依赖性,其作用机制可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

芦荟大黄素对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨芦荟大黄素(AE)对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。方法将人脑胶质瘤SHG44细胞分为对照组(未经药物处理)及实验组(AE浓度分别为20、40、80和160μmol/L);采用CCK-8法检测AE对SHG44细胞增殖的影响;应用流式细胞仪检测AE不同浓度处理组胶质瘤细胞凋亡情况;通过比色法测定细胞内caspase-3的相对活性。结果 AE对SHG44细胞生长具有抑制作用,且呈浓度依赖性;随着AE浓度的增高,凋亡率逐渐增加,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);AE作用于SHG44细胞后,处理组的Caspase-3相对活性明显升高,并存在浓度依赖关系。结论 AE能够抑制胶质瘤SHG44细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,相关机制可能涉及Caspase-3活化。

电离辐射和三氧化二砷联合对人脑胶质瘤SHG44细胞的杀灭作用

目的 研究电离辐射联合三氧化二砷(As2O3)对人脑胶质瘤SHG44细胞的杀灭作用。方法 以SHG44细胞为实验对象,用四氮唑盐(MTT)比色法观察不同剂量的电离辐射、单独As2O3及不同剂量的电离辐射和As2O3联合对SHG44细胞的杀灭作用;用激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化。结果 (1)照射与As2O3联合组SHG44细胞存活率低于单独相应剂量照射组(P<0.01)和单独As2O3组(P<0.01);(2)2Gy剂量照射+4μmol／L As2O3组对SHG44细胞杀灭作用强于6Gy剂量单独照射组(P<0.01),相当于8Gy单独照射组(P>0.05);(3)激光共聚焦显微镜下观察到As2O3处理组细胞出现明显的凋亡形态学变化。结论 电离辐射和As2O3联合对SHG44细胞的杀灭作用分别强于电离辐射和As2O3单独作用;

姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭、迁移的影响

目的探讨姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭和迁移的影响。方法胶质瘤SHG44细胞使用含10%胎牛血清DMEM培养基培养,终浓度分别5、10、20、40μmol/L姜黄素作用24、48、72 h;对照组加入等量二甲基亚砜。CCK-8比色法检测细胞增殖活力;细胞划痕实验检测细胞迁移距离及迁移率;Transwell实验细胞侵袭能力;免疫印迹法检测胶质瘤SHG44细胞基质金属蛋白酶(MMP)2、9表达。结果姜黄素对SHG44细胞生长具有显著抑制,且呈时间与浓度依赖性(P<0.05);最佳作用浓度在10~20μmol/L。与对照组相比,姜黄素作用后,SHG44细胞迁移距离、迁移率、侵袭能力明显降低(P<0.05),SHG44细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论姜黄素可抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖,进而抑制细胞的迁移及侵袭能力,且呈时间及浓度依耐性,其机制可能与下调MMP2和MMP9蛋白表达有关。

HIF-1α对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其机制

目的探究过表达低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其可能机制。方法体外培养SHG44细胞,转染过表达HIF-1α入SHG44细胞,评估HIF-1α转染效率;对比分析HIF-1α过表达对SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭的影响;ELISA法检测肿瘤相关炎性反应因子(TNF-α,IL-10,IL-17和IL-1β),Western blot检测SHG44细胞焦亡相关蛋白[炎性小体3(inflammasome3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、GSDMD、GSDME和转化生长因子-β_(1)(transforming growth factor-β_(1),TGF-β_(1))]的表达,明确HIF-1α对焦亡的关系。结果HIF-1α过表达后SHG44细胞明显肿胀增多,细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力较对照组明显增强,与对照组相比肿瘤炎性因子(TNFα,IL-10和IL-1β)表达水平均明显升高,而肿瘤炎性反应抑制因子IL-17表达水平明显下降;HIF-1α过表达后焦亡相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDME和TGF-β_(1))表达明显上调(P<0.05)。结论HIF-1α过表达可能通过促进焦亡提高SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力。

^(125)IUdR对人脑胶质瘤细胞SHG44的杀伤作用

为评价12 5IUdR对人脑胶质瘤细胞SHG4 4的杀伤作用 ,把12 5IUdR加入到SHG4 4细胞的培养基中 ,孵育后测量细胞摄取12 5IUdR的放射性活度 ;采用克隆形成法测定12 5IUdR对SHG4 4细胞生长抑制的效果。结果表明 ,培养基中12 5IUdR浓度增加时 ,SHG4 4细胞对12 5IUdR的摄取量也相应增加 (相关系数r =0 .9917)。SHG4 4细胞摄取12 5IUdR后生长受到明显抑制 ,细胞存活分数与培养基中12 5IUdR浓度呈直线负相关 (r =- 0 .9736 ) ,其半数致死剂量LD50 为 (8.7± 0 .12 )kBq/mL ,12 5IUdR组的SHG4 4细胞存活分数明显低于Na12 5I组 (P <0 .0 0 1)。结果提示 ,12 5IUdR能够掺入到SHG4 4细胞中 ,12 5IUdR对SHG4 4细胞有明显的杀伤作用 ,说明12 5IUdR可望成为治疗脑胶质瘤的潜在的一种放射性药物。

直接和间接共培养条件下人脐带间充质干细胞对恶性胶质瘤细胞系SHG44生长的抑制作用

背景:SHG44是一种恶性胶质瘤细胞系,其生物学性状稳定、易于培养,广泛应用于动物成瘤模型制作,目前对其研究主要集中在运用药物、基因转染及电离辐射等途径抑制其生长,未见间充质干细胞对其作用的相关报道。目的:通过直接和间接共培养的方法,探讨人脐带间充质干细胞对恶性胶质瘤细胞系SHG44的作用,观察SHG44胶质瘤细胞数量及细胞周期的变化。方法:将人脐带间充质干细胞与SHG44细胞,分别在24孔板进行直接共培养,在Transwell板进行间接共培养,分别设对照组。培养3d后在荧光显微镜下观察,并收集Transwell板中的SHG44胶质瘤细胞,应用流式细胞术分别检测SHG44细胞周期。结果与结论:直接接触共培养组SHG44胶质瘤细胞数量少于对照组(P<0.05)。Transwell间接接触共培养组SHG44胶质瘤细胞数量与对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05),其细胞周期位于G0/G1期的SHG44胶质瘤细胞比率高于对照组(P<0.05)。证实,体外培养的人脐带间充质干细胞可以通过直接及间接接触抑制恶性胶质瘤细胞系SHG44细胞的生长。

DAPT对人胶质瘤细胞系SHG-44增殖的抑制作用及机制

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对人脑胶质瘤细胞系SHG-44细胞体外增殖的抑制作用及机制。方法应用不同浓度的DAPT作用SHG-44细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期及CD133+的肿瘤干细胞(TSC)数量的变化;应用RT-PCR及Western印迹法检测Notch通路关键分子(Notch-1,Delta-l,Hes-1)基因及蛋白水平的表达。结果 DAPT作用SHG-44细胞后,明显抑制了细胞增殖(P<0.05),且抑制作用呈剂量依赖性。细胞周期结果显示S期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例显著增加;CD133+的TSC数量明显减少。随着DAPT浓度的增加,Notch-1,Delta-l,Hes-1 mRNA及蛋白表达水平逐渐下降。结论 DAPT可以下调Notch通路中Notch-l、Delta-1、Hes-1的表达,减少TSC数量,抑制SHG-44细胞增殖。

PKB转染SHG44细胞辐射抗性机制的初步研究

目的 探讨通过抑制蛋白激酶B（PKB、AKT）活性增加辐射敏感性，从而证实PKB活性是诱导SHG44细胞辐射抗性的机制之一。方法采用电穿孔法将PKB基因[pCMV5．HA-m／p-PKBa（PKB）、pCMV5-HA-PKBα-DD（T308D／S473D）（PKBD）]转染SHG44细胞；MTT法检测对照、PKB转染组及照射后各组细胞增殖率，激光共聚焦显微镜扫描技术观察对照、对照＋照射、PKB转染＋照射、PKBD转染＋照射组细胞凋亡及微细结构的变化；分析PKB转染的SHG44细胞增殖以及诱导凋亡的相关因素。结果含有外源性PKB的质粒成功转染了SHG44细胞并表达PKBmRNA，而对照组未见表达；转染后的SHG44细胞增殖率与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）；60Coγ），线照射能诱导SHG44细胞凋亡，以细胞核形态变化为特征；PKB＋照射组SHG44细胞形态完整，偶见凋亡细胞；而PKBD＋照射与对照＋照射组相比凋亡更显著。结论PKB转染SHG44细胞能抵抗辐射诱导的细胞凋亡，证实PKB活性与SHG44细胞辐射抗性存在一定的相关性。

脂质体载体法将外源性野生型p53转染SHG_(44)细胞及验证

目的验证脂质体法将wtp53有效转染SHG44细胞。方法G418筛选,DNA分子班点杂交。结果用脂质体法将wtp53质粒转染SHG44细胞,G418筛选,24d形成新生细胞克隆,呈集落状;以wtp53cDNA为探针进行斑点杂交,放射自显影,wtp53pLXSN/SHG44细胞为阳性杂交信号,而亲代SHG44细胞及转染pLXSN的SHG44细胞为阴性信号,说明wtp53基因已成功地转导入SHG44细胞中。结论斑点分子杂交显示,基因转染成功,初步证实脂质体介导法能有效地将外源性p53基因转导入SHG44细胞。

转染wt-53基因对SHG_(44)细胞恶性表型的影响

目的 转染 wt- p5 3基因对 SHG44 细胞恶性表型的影响 .方法 脂质体介导法 ,将 wt- p5 3基因转导入 SHG44 人胶质瘤细胞 ,斑点杂交证实转染成功 ;观察阳性转染细胞在体外常规培养中生长速率 ,细胞倍增时间 ;平板集落形成率 .结果 转染 wt- p5 3的细胞生长速度明显减慢 ,倍增时间延长 (P<0 .0 1) ;细胞集落形成数明显减少 (P<0 .0 1) .结论 外源性野生型 p5 3基因对 SHG44 细胞的恶性表型有抑制作用 .

异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响

目的 探讨异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响。方法 采用含无血清达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（DMEM/F12）（含表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、B27）的悬浮细胞培养板培养、纯化胶质瘤干细胞，并通过CD133联合Nestin标记进行免疫荧光鉴定；实验分为对照组／[含二甲基亚砜（DMSO）／]、异甘草素（5~160 μmol/L）组、替莫唑胺（12.5～200 μmol/L）组、异甘草素＋替莫唑胺组（160 μmol/L＋12.5~200 μmol/L），通过细胞增殖毒性检测（CCK-8）法、流式细胞术、免疫荧光染色法分别检测细胞抑制率、细胞周期及干细胞表面相关分化蛋白表达情况。结果异甘草素随着浓度增加细胞抑制作用越强，且160 μmol/L时抑制率达32%，替莫唑胺随着浓度增加抑制作用越强，且200 μmol/L时抑制率达40%；异甘草素联合替莫唑胺组随着浓度增加抑制作用越强，且160 μmol/L＋200 μmol/L时抑制率达72%；随着异甘草素浓度增加G0/G1期细胞比例增加，细胞周期阻滞于G0/G1期；随着异甘草素浓度增加干细胞分化越多，且分化细胞的死亡越多。结论异甘草素能诱导SHG44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化，且能抑制增殖，同时增强替莫唑胺化疗敏感性。

异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响

目的探讨不同浓度异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及机制。方法实验分为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)对照组,异甘草素(10~160μmol/L)诱导组,氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1-alanyl]-S-ph,DAPT)(2.0μmol/L)阻断剂组,异甘草素+阻断剂组(10~160μmol/L+2.0μmol/L DAPT),采用CCK-8法、免疫荧光染色、Western blot及Real-time PCR分别检测细胞抑制率、相关分化蛋白及Notch1通路相关基因表达情况。结果异甘草素在12~48 h,随着浓度增加,细胞抑制率减弱(P<0.05),且分化细胞越多,干细胞减少;72 h后随着浓度增加,细胞抑制率增强(P<0.05),分化细胞及干细胞同时减少;隔日加药至第7 d时,经统计分析胶质瘤干细胞球数目减少、直径减小(与对照组比),且P<0.05。异甘草素作用72 h后:与对照组比较,随着异甘草素浓度的增加Nestin蛋白表达量逐渐下调(P<0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/L组GFAP蛋白表达水平均上调(P<0.05),且40μmol/L组GFAP蛋白表达量较其他浓度组均较高,(P<0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/L组β-TubulinⅢ蛋白表达水平均上调(P<0.05),且10μmol/L组β-TubulinⅢ蛋白表达量较其他浓度组均较高(P<0.05)。Notch1通路阻断剂作用后,与对照组比较,各异甘草素组和阻断剂组Notch1、RBP-JK及Hes1基因表达均显著下调(P<0.05);与异甘草素组比较,Notch1、RBP-JK及Hes1基因表达在异甘草素加DAPT组及阻断剂组显著下调(P<0.05);与阻断剂组比较,Notch1、RBP-JK及Hes1基因表达在异甘草素加DAPT组显著下调(P<0.05)。结论异甘草素能诱导SHG44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化,且能抑制其增殖,可能与下调Notch1信号通路中的Notch1、RBP-JK及Hes1有关。