基于SHH/GLI-1信号通路探讨齐墩果酸抑制结直肠癌小鼠移植瘤生长与炎症反应的作用机制

目的基于SHH/GLI-1信号通路探讨齐墩果酸(OA)对结直肠癌小鼠移植瘤生长与炎症反应的影响。方法选择SPF级6周龄雄性BALB/c裸鼠12只,采用皮下注射HT-29细胞构建结直肠癌移植瘤小鼠模型,随机分为对照组与干预组各6只。干预组按12.5 mg/(kg·d)予腹腔注射OA溶液,对照组按500μL/(kg·d)予腹腔注射生理盐水,给药6 d停止1 d,共干预16 d。干预期间每2 d测量小鼠体质量和肿瘤体积,干预结束后测量肿瘤重量;免疫组化法检测肿瘤组织增殖标志物Ki67、细胞周期相关蛋白[细胞周期素依赖性激酶抑制因子(p21)、周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)]、细胞凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X(Bax)、磷酸化-B淋巴细胞瘤-2死亡拮抗蛋白(p-Bad)、死亡因子(Fas)、死亡因子配体(FasL)]、炎症相关蛋白[环氧化酶-2(COX-2)、一氧化氮合酶(iNOS)]以及SHH/GLI-1信号通路相关蛋白[音猬因子(SHH)、补丁受体(PTCH)、光滑蛋白(SMO)、胶质瘤相关癌基因同源物1(GLI-1)]的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况;Bio plex检测2组小鼠血清炎症因子白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果2组不同时间段体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,干预组干预7、9、11、13、15、17、19 d小鼠肿瘤体积均明显减小(P<0.05),干预后肿瘤重量明显降低(P<0.05)。与对照组比较,干预组肿瘤组织Ki67、CDK4、Cyclin D1、Bcl-2、COX-2、iNOS、SHH、PTCH、SMO、GLI-1和血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达均明显降低(P<0.05),p21、Bax、p-Bad、Fas、FasL表达均明显升高(P<0.05);凋亡细胞比例明显增加(P<0.05)。结论OA可以抑制结直肠癌小鼠移植瘤的生长和炎症反应,可能与调控SHH/GLI-1信号通路相关。

扁蒴藤素调节Shh/Gli1信号通路对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和血管生成拟态的影响

目的:探讨扁蒴藤素(Pris)调节Shh/Gli1信号通路对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和血管生成拟态(VM)的影响及其机制。方法:采用MTT法检测不同浓度Pris对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,以选取合适的干预浓度。将HeLa细胞分为对照组、环巴胺组、Pris组、Pris+pc-NC组和Pris+pc-Shh组。采用MTT法、EdU法检测各组细胞的增殖能力,Transwell小室法、流式细胞术检测各组细胞的迁移及侵袭能力和细胞凋亡率,体外血管生成实验观察VM形成情况,qPCR法检测各组细胞中Shh和Gli1 mRNA表达水平,WB法检测细胞中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮钙黏素(VE-cadherin)、Ki-67、caspase-3及与Shh/Gli1信号通路相关蛋白表达水平。结果:0.25~2.5μmol/L的Pris对HeLa细胞增殖均有显著抑制作用,选择1.5μmol/L的Pris进行后续实验。对照组细胞形成良好的管腔结构,与对照组相比,环巴胺组、Pris组和Pris+pc-NC组HeLa细胞管腔结构被明显破坏,细胞增殖活力和增殖率、迁移及侵袭细胞数目、Shh和Gli1 mRNA、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、Shh、Gli1蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率和caspase-3表达均显著升高(均P<0.05);环巴胺组与Pris组HeLa细胞各项检测指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05);与Pris+pc-NC组相比,Pris+pc-Shh组细胞管腔结构形成明显改善,细胞增殖活力和增殖率、迁移及侵袭细胞数、Shh和Gli1 mRNA、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、Shh、Gli1蛋白表达均显著升高(均P<0.05),细胞凋亡率和caspase-3表达均显著降低(均P<0.05)。结论:Pris抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭和VM的形成并促进细胞凋亡,可能与阻断Shh/Gli1信号通路有关。

针刺调节Shh/Ptch1信号通路对帕金森认知障碍模型大鼠的神经保护作用研究

目的:探讨针刺治疗是否可通过调节Shh/Ptch1信号通路进而改善帕金森(PD)大鼠认知功能。方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组、针刺+环巴胺(Shh抑制剂)组、西药组(盐酸多奈哌齐)及针刺+西药组。采用Morris水迷宫检测空间学习记忆能力;ELISA法检测大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10及IL-1β)水平;商品化试剂盒检测脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平;HE染色观察大鼠海马组织形态变化;蛋白质印迹法检测大鼠海马组织活化半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、音猬因子(Shh)及补缀同源物1(Ptch1)蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠神经元有明显损伤,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著升高,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,针刺组、西药组和针刺+西药组大鼠神经元损伤显著减轻,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著降低,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与针刺组相比,针刺+环巴胺组大鼠神经元损伤显著加重,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著升高,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);针刺组和西药组各检测指标差异均无统计学意义(P>0.05);与针刺组和西药组相比,针刺西药组大鼠神经元损伤显著减轻,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著降低,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论:针刺治疗可降低PD认知障碍大鼠炎症反应和氧化应激,减轻神经元损伤,进而改善其认知功能,可能是通过激活Shh/Ptch1信号通路实现的。

肉桂醛调节Shh/Gli1信号通路对幽门螺旋杆菌胃炎大鼠胃黏膜损伤的影响

目的 探讨肉桂醛调节音猬因子(Shh)/Gli家族锌指蛋白1(Gli1)信号通路对幽门螺旋杆菌(Hp)胃炎大鼠胃黏膜损伤的影响。方法 将大鼠随机分为对照组、模型组、肉桂醛低剂量组、肉桂醛中剂量组、肉桂醛高剂量组、替普瑞酮组、肉桂醛高剂量+Shh激活剂Purmorphamine(PUR)组,每组18只。通过灌胃Hp的方法构建胃炎大鼠模型。建模成功后,肉桂醛低、中、高剂量组大鼠分别灌胃12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg肉桂醛,替普瑞酮组大鼠灌胃0.13 g/kg替普瑞酮,肉桂醛高剂量+PUR组大鼠给予50 mg/kg肉桂醛灌胃和6.67 mg/kg PUR腹腔注射,每天给药1次,持续2周。HE染色检测大鼠胃黏膜组织病理变化;透射电镜观察大鼠胃黏膜细胞形态。将GES-1细胞分为vitro-对照组、vitro-模型组、vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组、vitro-替普瑞酮组、vitro-肉桂醛高剂量+PUR组。除vitro-对照组外,其他组GES-1细胞均需被Hp感染,感染结束后,vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组分别用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L肉桂醛处理24 h;vitro-替普瑞酮组用1μmol/L替普瑞酮处理24 h;vitro-肉桂醛高剂量+PUR组用20μmol/L肉桂醛和1μmol/L PUR共同处理24 h,CCK-8法检测GES-1细胞增殖抑制率;ELISA法检测大鼠胃黏膜组织及GES-1细胞上清中白细胞介素1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测大鼠胃黏膜组织及GES-1细胞中Shh、Gli1蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠胃黏膜组织病理损伤严重,胃黏膜表面上皮细胞固缩,细胞膜破损,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,肉桂醛低剂量组、肉桂醛中剂量组、肉桂醛高剂量组、替普瑞酮组大鼠胃黏膜组织病理损伤、胃黏膜表面上皮细胞结构及形态有所改善,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与肉桂醛高剂量组比较,肉桂醛高剂量+PUR组大鼠胃黏膜组织病理损伤加剧,胃黏膜表面上皮细胞结构及形态破环严重,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05)。与vitro-对照组比较,vitro-模型组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05);与vitro-模型组比较,vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组、vitro-替普瑞酮组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与vitro-肉桂醛高剂量组比较,vitro-肉桂醛高剂量+PUR组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05)。结论 肉桂醛可能通过抑制Shh/Gli1通路减轻Hp诱导的胃炎大鼠胃黏膜损伤。

百事乐胶囊调控SHH/Gli1信号通路对抑郁模型大鼠海马神经再生的影响

目的 观察百事乐胶囊调控SHH/Gli1信号通路对抑郁模型大鼠海马神经再生的影响及作用机制。方法 32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组(5.4 mg/kg)和百事乐胶囊组(2.88 g/kg),每组8只。采用慢性不可预见性温和应激加单笼饲养法建立抑郁大鼠模型,于造模同时给药,连续21 d。糖水偏好实验、旷场实验评价大鼠抑郁样行为,ELISA检测大鼠血清和海马组织脑源性神经营养因子(BDNF)含量,免疫荧光染色观察海马齿状回5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、BrdU/双皮质素(DCX)、BrdU/神经元特异性核蛋白(NeuN)阳性细胞数,免疫荧光、Western blot检测大鼠海马组织SHH、Gli1及跨膜转导蛋白Smo、Ptch荧光强度和蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠糖水偏好度明显降低,水平和垂直运动次数明显减少(P<0.01),血清、海马组织BDNF含量明显下降(P<0.05),海马齿状回BrdU、BrdU/DCX、BrdU/NeuN阳性细胞数明显减少(P<0.01),海马组织SHH、Gli1、Smo、Ptch荧光强度及蛋白表达均明显降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,氟西汀组和百事乐胶囊组大鼠糖水偏好度明显升高,水平和垂直活动次数显著增加(P<0.05,P<0.01),血清、海马组织BDNF含量明显上升(P<0.05,P<0.01),海马齿状回BrdU、BrdU/DCX、BrdU/NeuN阳性细胞数明显增加(P<0.01,P<0.05),海马组织SHH、Gli1、Smo、Ptch荧光强度和蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论 百事乐胶囊可通过调控SHH/Gli1信号通路促进抑郁模型大鼠海马神经再生,进而发挥抗抑郁作用。

山姜素调节Shh/Gli1信号通路对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用研究

目的:探究山姜素调节Shh/Gli1信号通路对缺血性脑卒中(IS)大鼠的神经保护作用。方法:随机选择15只大鼠作为对照组,其余大鼠构建IS模型,造模成功的大鼠随机分为模型组、山姜素组(5 mg/kg)、Shh/Gli1信号通路抑制剂环巴胺组(15 mg/kg)、山姜素+环巴胺组(5 mg/kg山姜素+15 mg/kg环巴胺),每组15只,给药1次/d,连续2周,对照组和模型组给予等量生理盐水。Zea-Longa评分法评估神经功能;ELISA检测炎症因子水平;称量脑组织质量,计算脑组织含水量;TTC染色测定脑梗死体积;HE染色观察神经细胞损伤;TUNEL染色检测神经细胞凋亡;qRT-PCR、Western blot检测Shh和Gli1 mRNA和蛋白表达。结果:对照组海马组织无任何异常现象,模型组大鼠海马组织结构异常,细胞排列紊乱,神经细胞出现核固缩现象,模型组较对照组细胞损伤率、Zea-Longa评分、梗死体积、IL-1β、IL-6、TNF-α、脑组织含水量、细胞凋亡率均显著升高(P<0.05),Shh、Gli1 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,山姜素组细胞排列较为整齐,神经细胞核固缩现象改善,细胞损伤率、Zea-Longa评分、梗死体积、IL-1β、IL-6、TNF-α、脑组织含水量、细胞凋亡率均显著降低(P<0.05),Shh、Gli1 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05),环巴胺组以上指标趋势相反,环巴胺逆转了山姜素对IS大鼠的神经保护作用。结论:山姜素可能通过激活Shh/Gli1信号通路对IS大鼠起神经保护作用。

吴茱萸碱调节Shh/Gli1信号通路对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的影响

目的探讨吴茱萸碱(Evo)对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨损伤的影响及其作用机制。方法将60只大鼠随机分为对照组、模型组、Evo低剂量组、Evo中剂量组、Evo高剂量组、激活剂(Shh/Gli1信号通路激活剂Purmorphamine)+Evo高剂量组,每组10只。构建大鼠KOA模型,并对各组给予相应药物干预。对各组大鼠进行行为学观察及Lequesne MG评分,苏木素伊红(HE)染色和番红O-固绿染色观察大鼠软骨组织病理变化及Mankin评分,酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测软骨细胞凋亡,免疫组织化学检测Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)、基质金属蛋白酶13(MMP13)蛋白表达,Western blotting检测Shh、Smo、Ptch1、Gli1蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠出现活动障碍、软骨组织损伤严重,Lequesne MG评分、Mankin评分、IL-1β、IL-18、TNF-α水平、软骨细胞凋亡率、MMP13蛋白表达及Shh、Smo、Ptch1、Gli1蛋白水平显著升高,CⅡ蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,Evo低、中、高剂量组大鼠活动障碍、软骨组织受损减轻,Lequesne MG评分、Mankin评分、IL-1β、IL-18、TNF-α水平、软骨细胞凋亡率、MMP13蛋白表达及Shh、Smo、Ptch1、Gli1蛋白水平显著下降,CⅡ蛋白表达升高(P<0.05);Shh/Gli1信号通路激活剂逆转Evo高剂量对KOA大鼠软骨损伤的改善作用。结论Evo可能通过抑制Shh/Gli1信号通路减轻KOA大鼠炎症反应和软骨细胞凋亡,改善软骨损伤。

隐丹参酮调节Shh/Gli1信号通路对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

目的:探讨隐丹参酮(CRY)调节Shh/Gli1信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤的影响。方法:通过开胸及结扎左前降支建立AMI大鼠模型,并以仅开胸不结扎的大鼠为对照组,将AMI大鼠随机分为AMI组、不同剂量(5、15、45 mg/kg)的CRY组、CRY+环巴胺[Cyclopamine(20μg/kg)]组,各组按照相应剂量的药物进行干预,结束后检测左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVESD);ELISA检测心肌梗死指标-肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端B型利钠肽前体(NT-pro-BNP)水平;TTC、HE、免疫组织化学、TUNEL染色法分别检测大鼠心肌梗死、组织病理学、血小板内皮细胞粘附分子(CD31)变化及细胞凋亡变化;Western blot检测心肌组织Shh/Gli1相关蛋白表达。结果:与对照组比较,AMI组LVESD、血清中NT-pro-BNP、CK-MB、心肌梗死面积、CD31表达、心肌细胞凋亡明显增加,LVEF、心肌组织中Shh、Gli1蛋白表达则降低(均P<0.05);与AMI组比较,加入不同剂量的CRY则降低了LVESD、血清中NT-pro-BNP、CK-MB、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡,提高了LVEF、心肌组织中CD31表达、Shh、Gli1蛋白表达,组间比较存在统计学差异(均P<0.05);与45 mg/kg CRY组比较,45 mg/kg CRY联合Cyclopamine则升高了LVESD、血清中NT-pro-BNP、CK-MB、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡,降低了LVEF、心肌组织中CD31表达及Shh、Gli1蛋白表达(均P<0.05)。结论:CRY通过调节Shh/Gli1信号通路改善AMI大鼠心肌损伤。

SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌细胞凋亡诱导作用的实验研究

研究Sonic Hedgehog信号通路(SHH)是否参与转录因子叉头框Q1基因(FOXQ1)引起胃癌细胞凋亡。观察癌旁组织及癌灶周围淋巴结转移瘤对该信号通路的影响并分析其机制。方法 采用qRT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞系中FOXQ1的表达情况,FOXQ1 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞设为si-FOXQ1组,同时设置转染正常对照组(Normal)和阴性对照组(si-Control),qRT-PCR和Western blot检测FOXQ1基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白及SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。通过对以上指标进行比较分析,探讨了不同胃癌细胞间以及同一胃癌细胞系内两种癌细胞之间是否存在差异。结果 FOXQ1在胃粘膜上皮细胞GES-1中的表达明显低于胃癌细胞(P<0.05),FOXQ1在胃癌SGC-7901细胞中的表达最高,可作为后续实验研究的对象。结论 胃癌细胞内FOXQ1基因高度表达;SHH信号通路与FOXQ1基因有关,其诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡是通过上调Bax及Cleaved Caspase3等蛋白的表达而实现。

节律因子BMAL1通过SHH信号转导通路影响胃癌MGC-803细胞的增殖

背景与目的:节律因子BMAL1除了在维持正常生物节律中发挥核心作用外,也参与多种肿瘤的演进过程,但其具体作用机制还未完全阐明。探讨节律因子BMAL1对胃癌细胞增殖的影响及下游信号转导通路。方法:应用靶向BMAL1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)进行细胞转染(si-BMAL1组),并设置乱序阴性对照(negative control,NC)组,通过蛋白质印迹法(Western blot)验证细胞转染效率。分别采用MTT法和平板集落形成实验检测细胞的活力和增殖情况,采用Western blot测定细胞中增殖相关功能蛋白cyclin D1的表达水平以及SHH信号转导通路蛋白SHH、SMO、GLI1的表达变化。采用SHH信号通路抑制剂环巴胺处理BMAL1下调后的MGC-803细胞,采用Western blot检测SHH、SMO、GLI1及cyclin D1的蛋白水平,采用平板集落形成实验检测细胞增殖能力的变化。结果:与NC组相比,si-BMAL1组细胞活力增强,细胞中cyclin D1的表达上调,SHH、SMO、GLI1的表达明显上调(P<0.05)。SHH抑制剂环巴胺处理干扰BMAL1的MGC-803细胞后,与si-BMAL1组相比,si-BMAL1+环巴胺组SHH、SMO、GLI1的蛋白水平下调,cyclin D1并未发生明显变化,si-BMAL1促进胃癌细胞增殖的作用可被环巴胺所逆转。结论:BMAL1可能通过SHH信号转导通路抑制胃癌MGC-803细胞的增殖。

Shh信号通路抑制剂Jervine对骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞的作用

目的:研究Shh信号通路中SMO抑制剂(Jervine)对骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞株的增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能的作用机制。方法:应用CCK-8法检测Jervine对MUTZ-1细胞增殖的影响;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测Jervine对MUTZ-1细胞凋亡及细胞周期的作用;Western blot法检测Shh信号通路效应蛋白BCL2和CyclinD1的表达水平;荧光实时定量PCR法(RT-qPCR)检测Jervine作用于MUTZ-1细胞后Shh通路中Smo和Gli1基因的表达。结果:不同浓度Jervine对MUTZ-1细胞生长具有抑制作用,且抑制率呈剂量依赖性增加(24 h,r=-0.977);Jervine能有效促进细胞凋亡,并且细胞凋亡率与Jervine剂量成呈相关(r=0.997);加入不同浓度Jervine后G1期细胞所占比重增多,S期细胞减少(P<0.001),Jervine可使MUTZ-1细胞周期阻滞于G1期,抑制细胞增殖。Jervine作用MUTZ-1细胞后Smo和Gli1基因表达水平及下游靶基因的BCL2和CyclinD1蛋白表达水平都明显下降(P<0.05)。结论:SMO抑制剂能有效抑制MUTZ-1细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与下调BCL2和CyclinD1蛋白表达水平相关。

SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌细胞凋亡诱导作用的实验研究

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是否参与转录因子叉头框Q1(FOXQ1)基因诱导的胃癌细胞凋亡。方法:采用q RT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞系中FOXQ1的表达情况,FOXQ1 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞设为si-FOXQ1组,同时设置转染正常对照组(Normal)和阴性对照组(si-Control),q RT-PCR和Western blot检测FOXQ1基因和蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白及SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。结果:FOXQ1在胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达显著低于胃癌细胞(P<0.05),胃癌SGC-7901细胞中FOXQ1的表达最高,作为后续实验研究对象。转染FOXQ1 siRNA后SGC-7901细胞中FOXQ1的表达显著下降(P<0.05)。si-FOXQ1组凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著高于si-Control组(P<0.05),而SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达显著低于si-Control组(P<0.05)。Normal组和si-Control组间以上各指标差异无统计学意义(P>0.05)。SHH特异性激活剂purmorphamine能够逆转转染FOXQ1 siRNA诱导的SGC-7901细胞凋亡。结论:FOXQ1基因在胃癌细胞中呈高表达,SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用,通过上调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达来实现。

FOXQ1介导SHH信号通路诱导胃癌细胞凋亡

目的探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是否参与转录因子叉头框Q1(FOXQ1)基因诱导的胃癌细胞凋亡。方法培养人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS,qRT-PCR检测细胞中FOXQ1 mRNA表达水平。分别转染si-FOXQ1(si-FOXQ1组)、阴性对照si-Control(si-Control组)至SGC-7901细胞,并设置正常对照组(Normal组),转染时间为48 h;用1μmol/L的SHH特异性激活剂purmorphamine(PM)诱导si-FOXQ1组细胞24 h,记为si-FOXQ1+PM组,以si-FOXQ1组细胞为对照。采用qRT-PCR和Western blot法分别检测各组SGC-7901细胞中FOXQ1 mRNA和蛋白表达水平,流式细胞仪检测SGC-7901细胞凋亡率,Western blot检测SGC-7901细胞中Bax、Cleaved Caspase3、SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。结果与GES-1细胞比较,SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS细胞中FOXQ1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),且SGC-7901细胞中FOXQ1的表达最高(P<0.05)。与si-Control组比较,si-FOXQ1组SGC-7901细胞mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。Normal组和si-Control组间以上各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与si-FOXQ1组比较,si-FOXQ1+PM组SGC-7901细胞凋亡率显著降低(P<0.05),Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05),SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论FOXQ1在胃癌细胞中高表达,沉默FOXQ1可能通过介导SHH信号通路诱导胃癌细胞凋亡,是治疗胃癌的潜在靶点。

Shh信号通路对快速老化小鼠肾脏衰老的影响

目的探究Shh信号通路的异常激活对肾脏纤维化的影响。方法用10月龄快速老化(SAMP)8小鼠与同龄抗快速老化(SAMR)1小鼠进行比较,采用苏木素-伊红(HE)、马松(Masson)染色方法观察肾小球、肾小管间质病理形态改变和纤维化程度;免疫荧光法检测Shh、平滑蛋白(Smo)、胶质瘤相关癌基因同源物(Gli1)蛋白的表达。结果与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠肾脏可见肾小球及小管间质纤维化明显,Shh、Smo、Gli1蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论衰老肾脏纤维化的程度可能与Shh信号通路的异常活化密切相关。

Shh和Gli-1在人乳腺癌MCF-7耐药细胞株中的表达及意义

目的研究Shh和Gli-1在人乳腺癌耐药株中的表达情况,探讨Hedgehog信号通路与乳腺癌耐药的关系。方法高浓度间歇诱导法建立人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/PTX,MTT法检测紫杉醇(PTX)对MCF-7与MCF-7/PTX细胞的半数抑制浓度(IC_(50))。实时定量PCR(QPCR)检测MCF-7、MCF-7/PTX细胞中Shh、Gli-1 mRNA的表达。Western blotting检测MCF-7、MCF-7/PTX细胞中Shh、Gli-1蛋白的表达。结果 PTX对MCF-7细胞的IC_(50)为(0.10±0.02)mg/L,对MCF-7/PTX细胞的IC_(50)为(5.30±0.01)mg/L;耐药指数为53.0。Shh mRNA在MCF-7、MCF-7/PTX细胞中的表达量分别为0.78±0.12和1.45±0.56(P<0.01);Gli-1 mRNA在MCF-7、MCF-7/PTX细胞中的表达量分别为1.86±0.02和3.56±0.26(P<0.01)。Shh蛋白在MCF-7、MCF-7/PTX细胞中的表达量分别为0.58±0.06和1.03±0.22(P<0.01);Gli-1蛋白在MCF-7、MCF-7/PTX细胞中的表达量分别为1.17±0.12和2.78±0.09(P<0.01)。结论人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/PTX高表达Shh、Gli-1,化疗药物可能通过上调Hedgehog信号通路相关蛋白及基因介导乳腺癌耐药,针对该信号通路的靶向治疗将是克服乳腺癌耐药的一个新的选择。

局灶性脑缺血大鼠纹状体区域Shh信号通路成分的表达变化及对髓鞘修复的影响

目的检测Sonic Hedgehog(Shh)信号通路及其转录因子Gli1在局灶性脑缺血后不同时间点的表达变化,探讨该通路对脑缺血后髓鞘再生的影响。方法线栓法建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,使用免疫组化和RT-PCR的方法观察脑缺血后1 d,3 d,7 d和14 d Shh,Gli1的表达变化。碱性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)是髓鞘的组成成分,用作髓鞘的标志物,观察脑缺血后上述各时间点MBP的表达变化。结果正常大鼠Shh和Gli1广泛分布于脑白质和灰质,如皮质,胼胝体和纹状体等区域。Shh和Gli1的表达在脑缺血后3 d^14 d呈逐渐上升趋势。MBP的表达在脑缺血后1 d^28 d逐渐下降。结论脑缺血性损伤可激活Shh信号通路,激活的Shh可能通过调控细胞的增殖参与神经修复,针对Shh的表达量进行干预治疗将为脱髓鞘疾病的治疗提供理论依据。

补阳还五汤通过小窝蛋白1调控Shh信号通路促进脑缺血后星形胶质细胞转分化

目的基于小窝蛋白1(caveolin-1,Cav1)/音猬因子(sonic hedgehog,Shh)信号通路探讨补阳还五汤对脑缺血后星形胶质细胞转分化的作用机制。方法雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及补阳还五汤低、中、高剂量(9.25、18.50、39.00 g/kg)组和丁苯酞(54 mg/kg)组,除假手术组外,其余各组采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法复制脑缺血模型,给予药物干预21 d后,采用神经行为学评分、苏木素-伊红染色及免疫组化评估补阳还五汤疗效。随后将雄性野生(WT)小鼠及Cav1−/−(KO)小鼠分别随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤(18.5 g/kg)组,造模前7 d予以脑内注射GFAP-EGFP腺相关病毒,采用MCAO法制备脑缺血模型,给予药物干预21 d。采用免疫荧光检测缺血侧皮质区星形胶质细胞转分化情况,Western blotting法检测缺血侧皮质区Shh、平滑同源物(smootened,Smo)及神经胶质瘤关联癌基因同源物1(glioma associated oncogene homolog 1,Gli1)的蛋白表达,qRT-PCR法检测神经分化因子acoete-scute同系物1(achaete-scute complex homolog 1,Ascl1)、神经源性分化因子1(neurogenic differentiation 1,NeuroD1)、神经源性分化因子2(neurogenic differentiation 2,NeuroD2)、神经元素1(neurogenin-1,Ngn1)、神经元素2(neurogenin-2,Ngn2)及配对盒基因2(paired box gene 2,Pax2)的表达。结果与模型组比较,补阳还五汤各剂量组及丁苯酞组的神经行为学评分显著降低(P<0.05、0.01),缺血侧皮质区病理损伤明显改善,NeuN表达明显上升(P<0.05、0.01)。此外,补阳还五汤低剂量组和补阳还五汤中剂量组的神经行为学评分及NeuN的表达有显著差异(P<0.01),而补阳还五汤中、高剂量组及丁苯酞组之间无明显差异。与同基因型模型组比较,WT、KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质区EGFP-NeuN共定位明显增加(P<0.01),Shh、Smo及Gli1蛋白表达明显上升(P<0.05、0.01),神经分化因子Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2表达明显上升(P<0.05、0.01)。与WT模型组及WT补阳还五汤组比较,KO模型组及KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质EGFP-NeuN共定位明显下降(P<0.01),Shh、Smo及Gli1蛋白表达明显下降(P<0.05),神经分化因子Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2表达明显下降(P<0.05、0.01)。结论补阳还五汤能够促进脑缺血后星形胶质细胞向神经元转分化,其作用机制可能与通过Cav1调控Shh信号通路,上调各神经分化因子的表达有关。

TGF-β1通过上调Shh信号诱导大鼠脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的探讨TGF-β1在诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞中对Shh信号的影响。方法新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞经Ⅳ型胶原酶提取纯化。原代脑膜成纤维细胞随机分为3个组:分别为空白对照组、10 ng/mL TGF-β1处理组(TGF-β1组)、10 ng/mL TGF-β1联合20μmol/L TGF-β1受体抑制剂SB-431542组(TGF-β1+SB组)。各组细胞在药物处理前均用无血清培养基培养24 h后换用加入了药物的DMEM/F12完全培养基处理72 h。采用CCK-8法检测各实验组成纤维细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测各实验组成纤维细胞的迁移能力;免疫荧光法检测各实验组纤维连接蛋白(Fn)的表达;Westernblotting检测各实验组Fn、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Shh蛋白的表达;q-PCR检测各实验组细胞Shh mRNA的表达。结果TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的增殖(P<0.05);TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的迁移(P<0.05)。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并增加Fn的分泌(P<0.05)。TGF-β1处理后可上调Shh蛋白和mRNA的表达(P<0.05),TGF-β1受体抑制剂SB-431542则可抑制TGF-β1引起的原代脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并减少纤维连接蛋白的分泌(P<0.05)。结论TGF-β1可通过上调Sonic Hedgehog信号通路中Shh蛋白的表达,诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。

SHH信号通路对MCAO模型大鼠脑缺血后的保护机制分析

目的 探讨人重组Shh蛋白(SHH)信号通路对大脑中动脉梗死(MCAO)模型大鼠脑缺血后的保护机制。方法 SPF级SD大鼠36只随机分为假手术组、模型组和SHH组,每组各12只。大鼠MCAO模型制备采用线栓法制成,侧脑室注射外源性SHH蛋白激活SHH信号通路。神经功能依据Longa标准评分进行评价;采用TTC测定大鼠梗死体积;采用激光多普勒血流仪,记录左侧大脑中动脉供血区域血流变化值;实时荧光定量PCR法(RT-PCR)测定VEGF和Ang-1 mRNA表达;采用Western blot测定VEGF和Ang-1蛋白表达。结果 模型组和SHH组大鼠神经功能评分高于假手术组(P<0.05);SHH组大鼠神经功能评分低于模型组(P<0.05)。模型组和SHH组大鼠梗死体积高于假手术组(P<0.05);SHH组大鼠梗死体积低于模型组(P<0.05)。模型组和SHH组大鼠脑血流值低于假手术组(P<0.05);SHH组大鼠脑血流值高于模型组(P<0.05)。模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1相对表达量低于假手术组(P<0.05);SHH组大鼠VEGF和Ang-1相对表达量高于模型组(P<0.05)。模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值低于假手术组(P<0.05);SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值高于模型组(P<0.05)。结论 SHH信号通路可改善MCAO大鼠神经功能,降低梗死体积,通过上调VEGF和Ang-1表达促进血管新生。

胶质瘤相关癌基因1在肝细胞癌中的表达及其与Shh、Vimentin、E-cad-herin蛋白的相关性研究

目的:研究胶质瘤相关癌基因1(Gli1)在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征之间的关系,探讨Gli1表达与sonic hedgehog通路配体Shh、EMT标记物Vimentin以及E-cadherin表达的相关性,由此分析其在肝癌EMT过程中的作用。方法:收集63例肝细胞癌组织及相对应的癌旁组织应用免疫组化,RT-PCR法检测Gli1在肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况,同时应用免疫组化法检测Hedgehog信号通路配体Shh、EMT标记物Vimentin以及E-cadherin在肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况,使用Mann-Whitney U检验分析肝细胞癌组织与癌旁正常组织Gli1的mRNA含量以及蛋白表达差异。使用卡方检验分析Gli1蛋白在肝细胞癌组织中的表达与患者临床特征的关系。使用Spearmen秩检验分析肝细胞癌组织中Gli1蛋白表达分别与Shh、Vimentin及E-cadherin这三种蛋白表达的关系。结果:肝细胞癌组织中Gli1蛋白及mRNA含量明显高于癌旁正常肝组织;Gli1蛋白表达分别与肿瘤肝内转移或淋巴结转移(χ2=6.205,P<0.05)、门静脉侵袭(χ2=4.014,P<0.05)、高Edmonson病理分级(χ2=19.668,P<0.05)以及TNM肿瘤分期较晚(χ2=7.091,P<0.05)有关;肝细胞癌组织中Gli1蛋白表达与Shh(r=0.574,P<0.05)、Vimentin蛋白(r=0.467,P<0.05)表达呈明显正相关,而与E-cadherin蛋白(r=-0.439,P<0.05)呈负相关。结论:Gli1在肝细胞癌中表达增加,且与肝癌侵袭转移有关的临床病理特征具有相关性,Gli1可能在Shh配体的作用下激活Hedgehog信号通路,并可能诱导肝癌发生与侵袭转移相关的EMT过程。