SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。

全基因组SHIV-KB9克隆的构建及其在人、猴外周血单核细胞中的复制(英文)

将分别携带SHIV-KB9 (SIV/HIV-1 KB9) 基因组的3′端和5′端的两个半长克隆,体外连接成SHIV-KB9全基因组克隆。含有全长基因的质粒培养时易发生同源重组和缺失,采用JM109作为宿主菌以及30℃、低转速的培养条件,可保持质粒的稳定性。通过PCR , RT-PCR 和猴免疫缺陷病毒(SIV) gag p27 核心抗原滴度检测表明:感染性克隆SHIV-KB9可有效在人、恒河猴及食蟹猴的外周血单核细胞中复制。

SHIV-KB9感染中国恒河猴动物模型的建立

目的为了进一步确证SHIV-KB9感染中国恒河猴的病毒浓度范围,测试动物对病毒的适应性,明确该动物模型的可重复性。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流氏细胞术、血常规、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+T细胞数等证实,4.8×105 copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论本研究进一步明确了SHIV-KB9感染中国恒河猴的有效病毒浓度范围,确定了SHIV-KB9病毒感染中国恒河猴的病毒学、免疫学的测定指标,成功的建立了SHIV-KB9/中国恒河猴动物模型。

SHIV-KB9病毒中国恒河猴细胞适应株的制备

试验旨在研究体外制备SHIV-KB9病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。试验将SHIV-KB9半长质粒连接后转染CEMx174细胞,转染上清与正常恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P27抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存,测定病毒RNA载量和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV-KB9在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果表明,本研究共制备了95mLSHIV-KB9病毒原液,病毒载量为2.678×105拷贝/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL,gp120序列分析表明病毒未发生变异。10倍稀释的3个不同浓度的SHIV-KB9均静脉成功感染中国恒河猴,引起外周血CD4+/CD8+大幅下降。因此,此次制备的SHIV-KB9细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库建立SHIV-KB9/中国恒河猴模型。

Disease Progression Patterns of SHIV-KB9 in Rhesus Macaques of Chinese Origin in Comparison with Indian Macaques

Objective To develop a model of SHIV-KB9/Chinese origin rhesus （Ch Rh） macaques for vaccine research and to compare the pathogenesis of SHIV-KB9 in Ch Rh macaques with that reported in Indian rhesus （Ind Rh） macaques. Methods Seven mamu-A＊01 negative Ch Rh macaques were inoculated intravenously with 1-10000 MID50 of SHIV-KB9. The monkeys were monitored for viral load, CD4, CDS, SHIV-specific antibody and virus genetic variation. The results were compared with those previously observed in Ind Rh macaques. Results As compared to that observed in Ind Rh macaques, SHIV-KB9 in Ch Rh macaques displayed three identical disease progression patterns. However, the primary pattern was not identical between the two subspecies. The level of plasma viremia differed in SHIV-KB9-infected Ch Rh macaques which exhibited different outcomes from those in Ind Rh macaques. Generally, the values of viral load and the maintenance of CD4^＋ T cells were associated with humoral responses. Otherwise, the viral genetic distances （divergence, diversity） were larger in animals （M419, M425） with their CD4^＋ T cells profoundly depleted. Conclusion The model of SHIV-KB9/Ch Rh macaques displays a relatively slow progression to AIDS compared with Ind Rh macaques, which may more accurately reflect the potential of candidate vaccines in humans.

猕猴艾滋病模型EKM基因治疗效果观察

目的明确体外导入EKM基因的实验猕猴感染SHIV-KB9后，病毒复制和免疫反应情况，为基因治疗AIDS提供实验依据。方法用血清学方法筛选出无SIV、STLV、SRV／D和B病毒感染的猕猴7只，实验当天回输自体储备血75ml，同时采集猴外周血75m1进行CD4＋T细胞分离培养，并导入EKM基因，培养结束后收获细胞，静脉回输猴体后再进行SHIV-KB9感染。采用流式细胞术、血常规检测、病毒栽量检测和基因拷贝数检测的方法确定导入基因后的实验猕猴感染sHIV．KB9后体内病毒复制和免疫损伤情况。结果导入基因和回输细胞的实验猕猴其血浆病毒载量峰值都与已报道的推迟14d出现，比模型对照组推迟11d出现，血浆病毒载量峰值均比模型对照组峰值低。流式细胞术结果表明其CD4＋T细胞计数也稳定在一定水平，CD4／CD8比值未出现明显倒置。实验组猕猴在试验结束时均未发展为猴AIDS。结论自体回输导入EKM基因的CD4＋T细胞的猕猴AIDS模型其血浆病毒载量峰值与模型对照组峰值比较有迟后作用，且低于模型对照组峰值，与回输细胞的实验对照组没有明显区别，其更确定的效果还有待进一步的研究。