shRNA沉默HMGA2对食管癌ECA109细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨sh RNA沉默HMGA2对食管癌ECA109细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探究所涉及的相关机制。方法构建针对人HMGA2基因的sh RNA表达载体,瞬时转染至人食管癌细胞系ECA109中,24 h后应用蛋白免疫印迹法(WB)检测转染效率;应用MTT法比较转染后sh-HMGA2组与sh-NC组细胞增殖情况;应用流式细胞术检测HMGA2沉默对细胞凋亡的影响;应用Transwell测定评估HMGA2沉默对细胞迁移和侵袭能力的影响;应用WB检测HMGA2沉默对ECA109细胞内HMGA2、TGF-βRⅡ、Vimentin、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-xl、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响。结果与sh-NC组相比,sh-HMGA2组中HMGA2的蛋白表达水平降低(P﹤0.05)。MTT结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞增殖率明显降低(P﹤0.01)。流式细胞术结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞凋亡率增加(P﹤0.05)。Transwell测定结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组中ECA109细胞迁移和侵袭数量均减少(P﹤0.05)。WB结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞内Bax和E-cadherin表达水平增加,而Bcl-xl、Vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表达水平均降低(P﹤0.05)。结论 sh RNA沉默HMGA2基因通过下调Bcl-xl表达、上调Bax表达水平来抑制食管癌细胞系ECA109细胞增殖并促进细胞凋亡,并通过抑制MMP及上皮间质转化来抑制细胞迁移和侵袭,这一过程涉及TGF-β/Smad信号通路。

shRNA沉默Sp1对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的探讨下调Sp1基因表达对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。方法设计并合成编码shRNA的寡核苷酸序列,克隆入LV3(H1/GFP&Puro)载体中构建重组体。然后重组慢病毒分别感染U251和U87细胞,嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株。荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中Sp1 mRNA和蛋白表达水平;克隆存活法检测细胞存活;流式法检测细胞周期;免疫荧光法检测DNA损伤程度。结果两株胶质瘤细胞在感染72 h后荧光显微镜观察Sp1慢病毒载体均高表达,RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示转染后shRNA-U87和shRNA-U251细胞Sp1 mRMA和蛋白表达量均明显降低(P<0.01),Sp1敲除率达90%以上。shRNA-U251和shRNA-U87细胞在10%细胞存活水平下的放射增敏比(SER)分别为1.39和1.18;两株Sp1敲除组细胞经辐照后G2/M期比率及γ-H2AX foci数目与对照组相比均极显著增大。结论shRNA沉默Sp1增大了X线诱导的G2/M期阻滞,加重了DNA双链断裂程度,提高了胶质瘤细胞的放射敏感性。

HK2在肝癌中的差异表达及其对肝癌细胞的影响

目的探究己糖激酶2(HK2)在肝癌组织中的差异表达及其对肝癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法收集48例肝癌组织及对应的癌旁组织,免疫组化检测HK2表达量;Western blot法检测人肝癌细胞Hep G2及正常肝细胞L-02中HK2表达量。统计并分析HK2表达与肝癌临床病理特征关系。构建4个HK2小发卡RNA(shRNA)载体,Western blot法检测干扰效率,选择沉默最优的建立稳定转染的细胞株。针对空白组(正常培养、未转染质粒)、control shRNA组(转染control shRNA)、HK2 shRNA组(转染shRNA_3) Hep G2细胞,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡。结果 HK2在肝癌组织中表达显著升高,其表达与肿瘤直径、TNM分期、组织病理分级存在相关性。HK2表达的降低可显著降低Hep G2细胞增殖活性,使得细胞周期发生明显转变,更少停滞在S期;显著升高Hep G2细胞凋亡率。结论HK2表现出了较强的抗肿瘤潜能,具有一定的临床意义,为将来基于HK2进行肝癌临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供新的思路和理论依据。