靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体共转染对HBV抗原表达的抑制作用

目的:探索靶向乙型肝炎病毒HBsAg基因的shR-NA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3及靶向HBeAg基因shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6共转染,对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV抗原表达的抑制作用。方法:以质粒PTZ为阴性对照,将自行构建的靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体按不同组合共转染HepG-2.2.15细胞;继续培养24 h后用MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果:psiHBV4+PgS2、psiH-BV4+PgS3在联合转染时,在细胞上清和裂解液中对HBsAg和HBeAg表达都有显著抑制作用(P<0.05),psiHBV5+PgS1、psiHBV6+PgS3对裂解液HBeAg表达抑制作用不显著(P>0.05)。结论:靶向HBs和HBe基因的两种载体psiH-BV4+PgS2、psiHBV4+PgS3共转染比单个载体转染更能显著减少HBV抗原的表达。

靶向小鼠整合素β_1的shRNA表达载体构建及鉴定

目的构建小鼠整合素β1的shRNA表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shRNA表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shRNA表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shRNA表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。

shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞株P-gp表达的抑制作用

目的探讨靶向mdr1基因的shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞(K562/ADM)P-gp表达的抑制作用。方法合成靶向mdr1基因的短发夹shRNA表达载体,转染K562/ADM细胞。利用RT-PCR检测转染细胞中mdr1基因mRNA,Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术分别检测P-gp的表达。结果在瞬时转染pSilencerTM3·1-H1neomdr1-A和mdr1-BshRNA表达载体的K562/ADM细胞中,mdr1基因mRNA转录分别减少到39·1%(P<0·05)和30·8%(P<0·01)。Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术检测显示P-gp表达被明显而特异地抑制。结论靶向mdr1基因的shRNA表达载体能够特异而有效地抑制耐药的人红白血病细胞中的P-gp表达。

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

目的:旨在观察不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰作用。方法:采用体外培养的Vero细胞,选用不同茎部长度串联shRNA表达载体+EGFP表达载体+脂质体转染的方法,将构建好的干扰载体转染Vero细胞,然后使用实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒,实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。结果:转染Vero细胞时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的4.3%、3.0%和6.9%;小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的2.5%、1.3%和5.1%。结论:在细胞和个体水平,不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90%以上),比单一位点产生的沉默效应要强许多,不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。

MicroRNA-21、PTEN基因真核及shRNA表达载体构建

目的：构建microRNA-21、PTEN基因真核表达载体pEGFP-N1-pre-试勉1、pEGFP-NI-PTEN及shRNA表达载体Psilencer4．1-CMV-mir21-shRNA、Psilencer4．1-CMV—FrrEN--shRNA。方法：根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shRNA及PCR引物。

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到空载体Pgenesil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功,并被成功转入宫颈癌HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达,48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。

LGR5 shRNA真核表达载体的构建及在MKN28细胞的干扰效果检测

构建并鉴定LGR5的shRNA真核表达载体,研究其对胃腺癌细胞LGR5基因表达的抑制作用.根据GenBank数据库提供的LGR5cDNA序列,选择设计一段靶向LGR5的shRNA序列,经退火成互补双链,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中,构建重组载体并测序鉴定.将构建成功的特异性表达载体(pGPU6/GFP/Neo-LGR5)转染人胃腺癌细胞系后,应用荧光显微镜分析转染效率.利用荧光实时定量PCR对细胞内源性LGR5的表达进行检测.测序结果表明:靶向LGR5的重组pGPU6/GFP/Neo-LGR5载体构建成功.荧光实时定量PCR结果显示:与对照组相比,LGR5shRNA真核表达载体可以使胃腺癌细胞中LGR5的mRNA水平明显降低78.96%(P<0.01).本工作可以为进一步研究LGR5在胃癌发生发展中的作用提供帮助.

MBP序列特异性shRNA质粒载体的构建及鉴定

目的:以pGenesil-1质粒为介导,构建针对MBP基因的shRNA表达载体。方法:设计特异性表达MBP shRNA结构的互补DNA序列3个及1个阴性对照序列,退火并克隆至质粒载体pGenesil-1中,转化DH5α菌株,进行重组质粒的酶切鉴定及测序分析。结果:经酶切鉴定及测序分析,筛选出的重组体测序结果和靶序列相同,成功构建了shRNA重组质粒载体pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3及pGenesil-1-MBP-neg。结论:成功构建MBP shRNA表达载体,为进一步研究MBP基因在细胞中的作用机制奠定基础。

shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF-7/AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究

目的探讨靶向增强型绿色荧光蛋白(EGFP)小发夹结构RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)对耐阿霉素的人乳腺癌细胞(MCF-7/AdrR)中EGFP基因表达的抑制作用。方法构建针对EGFP基因的shRNA表达载体,与pcDNA3.0EGFP质粒共转染MCF-7/AdrR细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜(Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM)和流式细胞术检测干扰效果。结果瞬时共转染pSilencerTM3.1-H1neoEGFPshRNA质粒和pcDNA3.0EGFP质粒后,荧光显微镜观察结果显示MCF-7/AdrR细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至35.6%,差异有显著性。结论靶向EGFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制EGFP在MCF-7/AdrR中的表达,MCF-7/AdrR细胞中存在RNA干扰现象,为进一步利用RNA干扰技术逆转乳腺癌多药耐药性的研究奠定基础。

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。

NEDD4-1 shRNA真核表达质粒的构建和鉴定

目的:设计并构建靶向NEDD4-1基因shRNA真核表达质粒。方法:依据靶基因序列设计siRNA,克隆入pGPU6/GFP/Neo载体U6启动子的下游,建立shRNA表达质粒系统,采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:将重组NEDD4-1 shRNA用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切。经酶切鉴定、测序分析,序列完全正确。结论:成功构建NEDD4-1 shRNA真核表达质粒,为进一步研究NEDD4-1在胶质瘤发生和发展中的作用提供实验基础。

抑制STAT3在胶质瘤细胞中的表达导致细胞凋亡

目的探讨Stat3基因在脑胶质瘤细胞中的表达及作用。方法将对应Stat3基因特异序列的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体转染到脑胶质瘤细胞株SHG44,观察细胞形态的变化;用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对细胞进行检测;RT-PCR分析Stat3的mRNA的表达量变化。结果转染shRNA表达载体使脑胶质瘤细胞形态发生显著变化;TUNEL实验观察到细胞凋亡数目明显增多,且凋亡细胞有明显荧光;RT-PCR结果显示转染后Stat3 mRNA的表达量明显下降。结论 Stat3蛋白在脑胶质瘤细胞正常生长中起到重要作用,抑制该蛋白在细胞中的表达会导致细胞凋亡。

pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2与其放射性配体结合的影响

目的研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体（pGenesil-1-MCHR2-shRNA）对MCHR2与其放射性配体结合特征的影响。方法将pGenesil-1-MCHR2-shRNA表达载体转染到稳定表达人MCHR2基因的中国仓鼠卵巢细胞CHO中，通过放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量（Bmax）及平衡解离常数（Kd值）的变化。结果与转染pGenesil-1空载体组比较，pGenesil-1-MCHR2-shRNA使Bmax减少39．4％～78．7％，Kd值升高40．9％～81．9％。结论MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效减少Bmax、升高kd值，为利用RNA干扰技术研究人MCHR2基因功能奠定良好的实验基础。

RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究

目的:探讨乙酰肝素酶shRNA抑制人卵巢癌细胞系乙酰肝素酶(HPSE)表达及对其侵润侵袭能力的影响。方法:针对HPSE mRNA的不同区域设计并构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳定转染细胞株,分别用RT-PCR和Western blot检验HPSE mRNA和蛋白表达受抑制情况,分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验测定细胞增殖能力,分别采用Matrigel Invasion,Transwell Migration和Adhesion Assay方法测定细胞体外侵袭、迁移和黏附能力。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测,结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比,差异有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达SKOV3细胞系,经RT-PCR和Western blot检验其HPSE表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,差异无统计学意义(P>0.05)。迁移能力实验中,干扰组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞黏附能力高于对照组(P<0.05)。侵袭能力实验干扰组低于对照组(P<0.05)。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,降低了卵巢癌细胞侵袭能力,黏附能力增强。

Survivin基因沉默对恶性胶质瘤U87细胞的影响

目的探讨Survivin基因沉默对人脑胶质瘤细胞株U87体外细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞,通过western法检测干扰48h后Survivin蛋白的抑制率,通过MTT法观察转染后24 h、48 h和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染后48 h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞48 h后,Survivin蛋白的抑制率约为78%;阻滞U87细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论Survivin shRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U87细胞Sur-vivin基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。

敲减人MCHR2基因抑制CHO细胞的放射性配体受体结合能力及Ca^2＋释放

研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2表达及特征的影响．将pGenesil-1-MCHR2-shRNA转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中，通过RT-PCR和Western印迹检测MCHR2表达的变化；放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量Bmax及平衡解离常数Kd值的变化；钙流检测实验观察配体MCH刺激后单个细胞Ca^2＋释放及MCH半数有效浓度EC50的变化,与转染pGenesil-1空载体组比较，pGenesil-l-MCHR2-shRNA能使MCHR2基因mRNA表达减少45．8％～66．4％；蛋白表达减少44．2％～81．0％；Bmax减少39．4％～78．7％，Kd值升高40．9％～81．9％；EC50升高114．8％～822．4％．MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效抑制MCHR2基因的表达，减少Bmax、升高虬值及EC50，从而对MCHR2生物活性等特征产生影响。

p100蛋白表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立

目的建立p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株，并初步探讨p100在HepG2肝癌细胞中的功能。方法用脂质体将含有真核细胞筛选标记Neo和GFP的p100 shRNA表达质粒转染入HepG2细胞。经G418耐药筛选稳定整合抗药基因的细胞单克隆；荧光镜检GFP阳性细胞单克隆，挑取单克隆；Western检测HepG2细胞稳定株HepG2（p100I）中p100表达的抑制效果；平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；MTS法检测细胞存活；划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得了p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株HepG2（p100I），其中p100的表达明显降低。并且实验表明，该p100表达抑制稳定株的克隆形成能力，抵抗化疗药物Cisplatin诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞。结论p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立为研究p100蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模型，基于此稳定株的研究，发现p100能够影响HepG2肝癌细胞的多种细胞功能。