毛蕊花苷对MPP^+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察肉苁蓉提取物毛蕊花苷对MPP+诱导的SHSY5Y细胞损伤的影响。方法用MTT法检测细胞存活率,以流式细胞仪检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,以及细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性,蛋白印迹测定Bcl-2的表达水平。结果200μmol·L-1MPP+处理细胞24h降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达38.9%;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性升高;而线粒体膜电位却明显降低。而预先给予0.1、1或者10mg·L-1浓度的毛蕊花苷处理细胞12h,可提高细胞存活率;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到29.5%,15.3%和8.6%,而且细胞内活性氧的水平明显降低,并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;caspase-3的活性不断降低,Bcl-2的表达水平增高,并呈现一定的剂量依赖性。结论毛蕊花苷能抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。

MPP^+对SHSY5Y细胞凋亡的诱导作用

目的 探讨 1 -methyl-4 -phenylpyridium iodide( MPP+)对 SHSY5Y细胞的毒性作用。 方法 采用体外培养的 SHSY5Y细胞 ,通过 TUNEL染色、细胞超微结构观察和 DNA倍体分析检测 MPP+对 SHSY5Y细胞凋亡的诱导作用。 结果 MPP+可明显地抑制 SHSY5Y细胞的生长 ,并诱导 SHSY5Y细胞发生凋亡 ,主要表现为TUNEL染色阳性的细胞增多 ,细胞核异染色质增多 ,线粒体肿胀、嵴断裂、消失 ,在 DNA周期中的 G0 -G1期前出现明显的亚二倍体峰。 结论 MPP+通过诱导 SHSY5Y细胞凋亡的方式发挥毒性作用。

葛根异黄酮对MPP^+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

目的探讨葛根异黄酮对甲基-苯基-吡啶离子(MPP^+)诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用与机制。方法建立人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞的体外MPP^+损伤模型,采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度葛根异黄酮对SHSY5Y细胞存活率的影响,采用RT-PCR法检测各Bcl-2和Bax表达水平。结果MPP^+处理的细胞活力较空白对照组降低,阴性对照组Bcl-2表达水平降低,而Bax表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与阴性对照组比较,葛根异黄酮组Bcl-2表达水平升高,而Bax表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论葛根异黄酮对MPP^+诱导的SHSY5Y细胞凋亡具有抑制作用,上调Bcl-2和下调Bax mRNA表达可能是其作用的机制之一。

去铁胺对帕金森SHSY5Y细胞的保护作用

目的探讨铁螯合剂去铁胺对MPP+诱导的帕金森病细胞模型的保护作用。方法培养SHSY5Y细胞,去铁胺预处理或未处理1 h,再给予MPP+48 h。利用MTT法检测细胞活力,Western blotting法检测CHOP和Caspase-12的表达,利用ROS特异性染料H2DCF-DA标记胞内ROS。结果 SHSY5Y细胞给予MPP+后细胞活力显著下降,内质网应激相关蛋白CHOP和Caspase-12的表达增加。表明去铁胺预处理后显著减轻MPP+所致的细胞损伤,同时降低内质网应激相关蛋白CHOP和Caspase-12的表达,并且去铁胺能够抑制ROS生成。结论去铁胺对MPP+制备的帕金森SHSY5Y细胞具有保护作用,与其抑制内质网应激作用相关。

葛根异黄酮对缺糖缺氧损伤SHSY5Y细胞的保护作用

目的探讨葛根异黄酮对缺糖缺氧损伤SHSY5Y细胞的保护作用。方法将SHSY5Y细胞分为空白对照组、损伤组、损伤+葛根异黄酮给药组(高、中、低浓度分别为200mg·L^(-1)、100mg·L^(-1)、50mg·L^(-1))共计5组,利用噻唑蓝(MTT)法检测各组SHSY5Y细胞的活力,用分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率;用黄嘌呤氧化酶法,测定超氧化物歧化酶(SOD)活力;用硫代巴比妥酸比色法,测定丙二醛(MDA)含量。结果与正常对照组比较,缺糖缺氧损伤组细胞活力和SOD活性显著降低,MDA含量和LDH释放率显著升高(均P<0.05)。与缺糖缺氧损伤组比较,不同剂量葛根异黄酮处理组抑制了这些指标的改变,其中,损伤+高浓度的葛根异黄酮组的细胞活力和SOD活性显著升高,MDA含量和LDH释放率显著降低(均P<0.05)。结论葛根异黄酮对缺糖缺氧损伤SHSY5Y细胞具有保护作用。

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3，JNK3）真核表达载体，并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板，PCR扩增人JNK3基因全长，目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3，酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞，并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系，荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达，RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体，并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系，与对照组相比，其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立，为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。

MALAT1抑制Aβ_(25-35)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖并促进细胞凋亡及其机制

目的探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病(AD)神经细胞的细胞周期、细胞增殖凋亡的影响。方法利用β淀粉样肽25-35(Aβ_(25-35))处理人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y建立AD细胞模型。将AD SH-SY5Y细胞随机分为对照组、p CDH空载体(p CDH-EV)组、MALAT1过表达(p CDH-MALAT1)组、抑制表达空载体(p SICOR-EV)组、抑制MALAT1表达(p SICOR-sh MALAT1)组。噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测转染48 h后的细胞周期和细胞凋亡率,Western blot法检测细胞BAX、Bcl2、胱天蛋白酶3(caspase-3)以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化的mTOR(p-mTOR)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化的GSK3β(p-GSK3β)蛋白水平。结果成功构建AD细胞模型和过表达及敲低MALAT1的表达载体。敲低MALAT1水平后,显著抑制AD模型细胞的增殖、细胞阻滞于G1期、促进细胞凋亡。同时上调BAX、caspase-3蛋白水平,下调Bcl2、p-PI3K、p-mTOR、p-GSK3β蛋白水平。过表达MALAT1则可逆转以上作用。结论敲低MALAT1水平可阻断PI3K/mTOR/GSK3β通路抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞增殖,促进细胞凋亡。

褐藻素对脂多糖活化小胶质细胞诱导神经元损伤的保护作用

目的探讨褐藻素是否对脂多糖(LPS)激活的小胶质细胞诱导神经元细胞损伤具有保护作用。方法采用LPS活化BV2小胶质细胞构建小胶质细胞激活模型。将BV2细胞分为6组:正常对照组、LPS组、低剂量褐藻素治疗组、高剂量褐藻素治疗组、正常低剂量褐藻素对照组、正常高剂量褐藻素对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组BV2细胞上清中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6水平;通过活性氧(ROS)试剂盒和线粒体膜电位试剂盒,采用流式细胞术分别检测各组BV2细胞的ROS水平和线粒体膜电位;采用CCK-8检测各组BV2细胞条件培养基与SH-SY5Y细胞共培养24 h后SH-SY5Y细胞的细胞存活率;采用膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)试剂盒、流式细胞仪检测各组SH-SY5Y细胞的凋亡情况。结果与正常对照组相比,LPS组TNF-α、IL-6水平明显增加(P<0.05);与LPS组相比,高、低剂量褐藻素治疗组TNF-α和IL-6水平均明显降低(P<0.05)。正常对照组和正常低、高剂量褐藻素对照组TNF-α和IL-6水平均无明显差异(P>0.05)。LPS组相较于正常对照组,BV2细胞ROS水平显著升高(P<0.05);高、低剂量褐藻素治疗组较LPS组BV2细胞ROS水平则显著降低(P<0.05)。正常对照组和正常低、高剂量褐藻素对照组ROS无明显差异(P>0.05)。与正常对照组相比,LPS组BV2细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05);高、低剂量褐藻素治疗组与LPS组相比,BV2细胞线粒体膜电位均显著升高(P<0.05)。正常对照组和正常低、高剂量褐藻素对照组线粒体膜电位无统计学差异(P>0.05)。LPS激活的BV2细胞条件培养基与SH-SY5Y共培养后,SH-SY5Y细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显增加(P<0.05);高、低剂量褐藻素治疗组与LPS组相比,SH-SY5Y细胞存活率均明显升高,而凋亡率则均明显降低(P<0.05)。正常对照组和正常低、高剂量褐藻素对照组细胞存活率和凋亡率均无统计学差异(P>0.05)。结论褐藻素可能通过减少促炎因子的释放、改善JC-1、抑制氧化应激水平,抑制小胶质细胞的过度活化和减少神经元凋亡,因而具有神经保护功能。

人参皂苷Rg1可能通过丝裂素活化蛋白激酶途径抑制细胞凋亡

目的 探讨人参皂苷Rg1对MPP+ 诱导细胞凋亡保护作用的可能信号传导途径。方法 用吖啶橙 溴化乙锭染色观察SHSY5Y细胞凋亡率 ,流式细胞仪检测细胞内活性氧ROS水平 ,WesternBlotting法检测JNK(c junNH2 terminalkinase)激酶活性 ,免疫细胞化学染色法检测裂解的Caspase 3阳性细胞的表达率。结果 经 10 μmol·L- 1 Rg1或 2 5mmol·L- 1 N 乙酰半胱氨酸预处理后 ,MPP+ 诱导的SHSY5Y细胞凋亡受到明显抑制 ,同时细胞内ROS下降 ,JNK激酶的活性减弱 ,裂解的Caspase 3阳性细胞表达率下降。结论 Rg1可抑制MPP+ 诱导的SHSY5Y细胞凋亡 ,其作用机制可能是通过清除ROS、减弱JNK激酶的活性 ,从而减少Caspase 3的激活。

抗氧化作用可能是人参皂甙Rg1抗细胞凋亡的机制

目的 :探讨人参皂甙Rg1对MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用及其可能的机制。方法 :用吖啶橙溴化乙锭染色观察SHSY5Y细胞凋亡率 ,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位及细胞内活性氧 (ROS)水平 ,WesternBlot法检测bcl 2、bax蛋白表达水平。结果 :经 10 μmol·L- 1Rg1预处理后 ,MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡受到明显的抑制 ,虽然线粒体跨膜电位无明显改变 ,但细胞内ROS下降 ,而bcl 2蛋白表达水平增加 ,bax蛋白表达水平减少。结论 :Rg1可抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡 ,其作用机制可能是通过清除ROS、调节bcl 2、bax蛋白表达水平起作用。

pEGFPN1-^(wt)HSP22和pEGFPN1-^(mt)HSP22载体的构建及其在人神经母细胞瘤细胞中的表达

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）是人类最常见的具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病。唐北沙等．成功定位了一个CMT2型大家系并将之命名为CMT2L，研究发现了小分子热休克蛋白22基因（HSP22）突变（423G→T，K141N）为CMT2L的致病突变。为研究HSP22的细胞内定位和生物学功能，我们运用体外基因重组技术构建pEGFPN1-^wtHSP22、pEGFPN1-^mtHSP22载体，转染SHSY5Y细胞后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的细胞内定位和聚集物形成情况。

水痘-带状疱疹病毒感染人神经母细胞瘤细胞的形态观察

目的研究水痘-带状疱疹病毒(VZV)在人神经母细胞瘤细胞株(SHSY5Y)中培养及增殖的特点,观察VZV感染SHSY5Y细胞后的生物学效应。方法于普通倒置显微镜和电子显微镜下观察被感染细胞的形态变化;利用CCK-8法检测VZV感染对细胞增殖的影响;比较不同感染复数(MOI)和不同浓度胎牛血清维持液对病毒增殖的影响。结果普通倒置显微镜下观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),从24h^96h,细胞病变数量增加和病变程度加重。电镜观察显示:感染48 h后核染色质固缩、浓染,线粒体肥大及增生,胞质空泡化和自噬小体形成,可见包装成熟的病毒颗粒。CCK-8法提示VZV感染24h后细胞增殖被抑制,各实验组存活率与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在2%胎牛血清的维持液中用MOI为1的VZV感染SHSY5Y细胞,能收获较高滴度的病毒。结论初步建立了VZV感染SHSY5Y细胞的体外模型,并利用该模型观察病毒感染对细胞生物性状的影响,为探讨VZV的致病及潜伏机制奠定了基础。

β淀粉样蛋白对人神经母细胞瘤细胞内质网应激的影响

目的研究β淀粉样蛋白(Aβ_(25~35))对人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)凋亡过程中内质网应激的影响,探讨在内质网应激过程中未折叠蛋白质反应途径(UPR pathway)在凋亡中的作用。方法将处于对数生长期的细胞分别暴露于含0(对照)、5、10、20、30、40μmol/L Aβ_(25~35)的培养基染毒48 h,采用CCK8法检测细胞活性。将对数生长期的细胞分别暴露于含0(对照)、5、10、15μmol/L Aβ_(25~35)的培养基染毒24、48和72 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白GRP78以及跨膜蛋白活化转录因子-6(ATF-6)、蛋白激酶-1(IRE1α)和RNA-激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)蛋白的表达水平。结果与对照组比较,各浓度Aβ_(25~35)染毒组SHSY-5Y细胞的存活率均较低,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高,SHSY-5Y细胞的存活率呈下降趋势。与对照组比较,各浓度Aβ_(25~35)染毒组SHSY-5Y细胞的凋亡率均较高,除5μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h外,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高和染毒时间的延长,SHSY-5Y细胞的凋亡率均呈上升趋势。与对照组相比,各剂量、时间点Aβ_(25~35)染毒组SHSY5Y细胞内质网ATF-6蛋白的表达水平较高;15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24、48 h和各剂量Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞内质网GRP78蛋白的表达水平较高;10、15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h和15μmol/L Aβ_(25~35)染毒48 h及各剂量Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞内质网IRE-1α蛋白的表达水平较高;15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h和10、15μmol/L Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞质网PERK蛋白的表达水平较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高和染毒时间的延长,细胞内GRP78、ATF-6、IRE1α和PERK蛋白的表达水平均呈上升趋势。结论 Aβ_(25~35)可以诱导SHSY5Y神经细胞内质网应激,导致SHSY5Y细胞发生凋亡。

基于网络药理学和实验验证探讨阿里红治疗阿尔茨海默病的作用机制

目的:利用网络药理学结合实验验证探讨阿里红治疗阿尔茨海默病(AD)可能的作用机制。方法:借助中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)平台及公开报道的文献数据获得阿里红化学成分;利用PharmMapper药效团匹配平台和TargetNet数据库综合筛选出成分预测靶点;通过基因表达综合数据库(GEO)、DrugBank数据库等获取AD疾病靶点,取交集得出阿里红可能的作用靶点,并对其使用STRING数据库和Cytoscape 3.7.1网络可视化软件分别构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和成分-靶点网络,且对网络进行拓扑分析;进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析筛选出阿里红主要作用通路及相关靶点蛋白,并用分子对接和体外细胞实验验证其结果。结果:共收集到阿里红24个候选成分和242个预测靶点,并得到与AD共同靶点96个,包括阿里红氨酸、3-酮基-去氢硫色多孔菌酸、齿孔酸等关键化合物和白蛋白(ALB)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、雌激素受体α基因(ESR1)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)等潜在的作用靶点;GO富集分析获得392个条目,主要跟β-淀粉样蛋白代谢途径和胆碱酯酶活性有关,KEGG富集分析获得77个条目,主要涉及雌激素信号通路、胆碱能突触、AD等生物学过程及通路;分子对接结果显示,阿里红7个关键成分与淀粉样前体蛋白(APP),BACE1,AChE,Caspase-3之间表现出良好的自发结合能力。体外细胞验证实验显示,与模型组比较,不同剂量阿里红组细胞存活率均显著上升(P<0.01)且具有浓度依赖性,同时可下调APP、BACE1、AChE、Caspase-3mRNA和蛋白表达量(P<0.05)。结论:该研究结果首次揭示了阿里红对AD治疗具有多成分、多靶点、多途径相互作用的特点,为后续阿里红防治AD作用机制研究提供了参考依据。