HSV-tk/ACV系统基因治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

本文首次应用HSV-tk/ACV系统对小鼠黑色素瘤B16进行了基因治疗研究。体外实验证实,转有HSV-tk基因的B16细胞(B16LNTK)对阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)的敏感性显著高于其亲本细胞B16,当B16LNTK与B16以不同比例混合培养时,亲本细胞B16对ACV的敏感性不同程度增高,存在旁观者效应。用B16LNTK接种同系C57BL/6小鼠,经ACV治疗20天后,B16LNTK组小鼠的肿瘤(0.254±0.18cm^3)较对照组B16组的肿瘤(4.43±1.08cm^3)小94％(n=5,双侧t检验P<0.01)。HSV-tk/ACV系统原位基因转移治疗B16荷瘤小鼠效果显著:HSV-tk/ACV治疗组肿瘤14天后较对照组肿瘤小43％(n=5,双侧t检验P<0.05)。结果提示HSV-tk/ACV系统可作为黑色素瘤基因治疗研究的一种有效方法。

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响

目的 探讨HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法 用阳离子脂质体Lipofectamine将 pCR3 Uni及含HSV TK基因的真核表达载体 pCR3 TK转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,阳性细胞克隆给予ACV(5 0mg/ml) ,72小时后 ,收集玻片 ,进行AgNOR染色。 结果 转染HSV TK基因的细胞 ,在给予ACV后 ,细胞增殖活性明显降低 ,转染 pCR3 Uni和 pCR3 \|TK细胞克隆的AgNOR颗粒数分别为 1 4.3 3和 6.67(P <0 .0 1 )。结论 AgNOR计数是一种操作简便、检测细胞增殖活性的方法 ,为研究HSV

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV基因系统抑制人肺癌生长的实验研究

目的:探讨阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV基因系统治疗人肺癌的实验研究的意义。方法:利用已构建的真核表达质粒pCR3-TK,用阳离子脂质体LipofectAMINE为载体,将pCR3-TK转染Anip973细胞株,然后给予不同浓度的Aciclovir(ACV)。结果:经MTT检测证实转染了TK基因的肺癌细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高,FCM检测可以看到凋亡峰的出现,且相应的S期细胞比率增高。结论:HSV-TK/ACV系统对人类肺癌细胞株Anip973具有良好的抑制作用;阳离子脂质体LipofectAMINE对人类肺癌细胞株Anip973安全、低毒,有可能成为基因治疗应用到临床试验的有价值的载体。

反转录病毒介导的 HSV-tk/ACV 系统基因治疗的安全性研究

研究了反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗脑肿瘤的安全性。首先采用ＰＣＲ、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以及补救分析方法，对ＨＳＶ－ｔｋ病毒包装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ）、Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液进行了检测。结果表明，所采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，是安全的；另一方面，采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ｔｋ基因的ＰＣＲ和病理切片观察方法，对ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统本身的安全性进行了探讨，结果表明ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗，ＡＣＶ及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统是安全的。

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究──Ⅱ.HSV-tk/ACV系统的安全性研究

采用细胞接种、X－gal染色、TK基因的PCR和病理切片观察，分别将PA317／BAG．PA317／TK产病毒细胞注射到动物体内，结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过1个月；产病毒细胞在体内没有形成肿瘤，也没有发现严重的炎症反应；HSV－tk／ACV系统用于动物基因治疗，ACV及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的HSV－tk／ACV系统在动物体内取得了安全的结果。

脂质体/DNA复合物介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和生物活性

目的：探讨脂质体／ＨＳＶ—ＴＫ重组 ＤＮＡ对膀胱癌细胞的转导和在细胞内的活性表达。方法：用脂质体／ＤＮＡ复合物将 ＨＳＶ－ＴＫ基因逆转录病毒重组子（ｐＬＸＳＮ－ＴＫ）导入膀胱癌细胞株 ＢＩＵ８７。携带 ＨＳＶ一ＴＫ基因的 ＢＩＵ８７细胞（ＢＩＵ８７—ＴＫ）由 Ｇ４１８筛选获得。经过 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和细胞原位杂交检测后，观测 ＡＣＶ对 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞存活的影响。结果： Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实 ＨＳＶ—ＴＫ基因存在于 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞染色体中。细胞原位杂交检测 ＨＳＶ－ＴＫｍＲＮＡ的表达。外源ＤＮＡ的导入以及ＨＳＶ－ＴＫ和Ｎｅｏ基因表达不会改变细胞生长特性。然而，在ＡＣＶ作用下，转导ＨＳＶ－ＴＫ基因的膀胱癌细胞的存活率受到影响，ＡＣＶ可显著抑制癌细胞生长。结论：脂质体／ＴＫ重组 ＤＮＡ复合物可用于膀胱癌细胞的转基因治疗。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因治疗人脑胶质瘤的实验研究

颅内恶性肿瘤以胶质瘤最为多见,胶质瘤的预后较差,一直困扰着神经外科医师。本文旨在观察阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法:本文将新近克隆并构建的含HSV-TK基因真核表达载体用阳离子脂质体介导转染至人脑胶质瘤细胞中,筛选出阳性克隆,通过MTT、FCM及AgNOR检测转染了HSV-TK基因的FJ905胶质瘤细胞对不同浓度的ACV的反应情况。结果:转染了TK基因的胶质瘤细胞在给予ACV后,细胞发生明显的肿胀、变性,以致形成碎片,而未转染TK基因的胶质瘤细胞变化不明显。转染TK基因和未转染TK的肿瘤细胞经ACV作用后,DNA的含量分别为65.81和109.43,两者之间差异显著(P<0.05)。AgNOR嗜银染色测定结果,转染了TK基因和未转染TK基因的肿瘤细胞经ACV作用后,两者测定结果分别为6.67±1.03和14.83±1.47,两者之间差异极显著(P<0.01)。结论:转染了TK基因的胶质瘤细胞对ACV的敏感性明显提高,ACV能明显抑制转染TK基因细胞的DNA合成;HSV-TK/ACV治疗后,人脑胶质瘤细胞的增殖活性降低了。提示HSV-TK/ACV系统可为胶质瘤的基因治疗提供一种可探索的方法。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV TK基因的真核表达载体pCR3 TK ,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,给予不同浓度的ACV ,观察不同时间对细胞的杀伤情况 ,并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高 (P <0 .0 1 ) ,ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3 TK转移 ,进行胶质瘤HSV TK/GCV基因治疗的研究 。

FRET检测tk基因诱导ACC-M细胞凋亡

研究肿瘤细胞凋亡是进行其药物筛选的重要方法之一。利用已构建的基于Caspase酶的指示剂CD3质粒与HSV-tk/ACV系统结合,通过荧光能量共振转移(FRET)技术研究了细胞凋亡,并采用ACV药物诱导表达了TK-GFP-CD3的ACC-M肿瘤细胞和CD3的ACC-M肿瘤细胞。结果表明,FRET成像检测分析出ACV药物能够诱导转有TK基因的人涎腺癌(ACC-M)肿瘤细胞凋亡,通过对仅转有CD3质粒的ACC-M肿瘤细胞没有影响。这种技术的结合可以用于细胞的凋亡药物的筛选。

应用带HSV－TK基因的重组腺病毒的肺癌基因治疗的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的腺病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分裂细胞有很强的杀伤作用。本文报道在感染复数（Ｍ．Ｏ．Ｉ，ＭｕｌｔｉＰｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到回１００％。四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９，ＬＡＸ，ＳＰＣ，ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的腺病毒（ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔＫ）的杀伤作用表现不同的敏感性。另外，Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）和ＧＣＶ对感染了重组腺病毒ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔＫ的细胞都有一定杀伤作用，但杀伤效果有很大差别；就Ａ５４９而言，ＧＣＶ的杀伤作用比ＡＣＶ高７—８倍。此外ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ结合ＧＣＶ杀伤肿瘤细胞时有“旁观者效应”，即感染了ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞与未感染细胞混合后，后者也明显地遭到杀伤。

运用HSV－tk／ACV系统进行肿瘤基因治疗研究

构建了含ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，将ＨＳＶ－ｔｋ基因转移至人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞（命名为ＳＨＧＬＮＴＫ）及小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６（命名为Ｂ１６ＬＮＴＫ）．体外实验证实核着类似物ＡＣＶ对ＳＨＧＬＮＴＫ细胞和Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞的杀伤敏感性分别高于亲本细胞１０００和４００倍．转ＨＳＶ－ｔｋ基因细胞与亲本细胞按不同比例共培养时，亲本细胞对ＡＣＶ的敏感性明显增高，存在旁观者效应．首次应用人脑胶质瘤细胞株进行裸鼠体内实验，结果表明：ＡＣＶ能完全抑制ＳＨＧＬＮＴＫ细胞在裸小鼠体内肿瘤的形成，对裸小鼠体内已形成的ＳＨＧＬＮＴＫ肿瘤的治疗效果与对照ＳＨＧ４４肿瘤相比，肿瘤体积缩小８０％；用Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞接种同系Ｃ５７／ＢＬ小鼠，经ＡＣＶ治疗后，Ｂ１６ＬＮＴＫ组小鼠的肿瘤较对照组Ｂ１６肿瘤小９５％．ＨＳＶ－ＴＫ／ＡＣＶ系统原位基因转移治疗ＳＨＧ荷瘤裸小鼠、Ｂ１６荷瘤小鼠，原位注射病毒悬液／ＡＣＶ治疗组的ＳＨＧ肿瘤、Ｂ１６肿瘤分别较对照组肿瘤小５０％，４３％，原位注射ＰＡ３１７／ＬＮＴＫ细胞，ＡＣＶ治疗的ＳＨＧ肿瘤较对照组肿瘤小９０％，以上实验结果，统计学上差异极显著，Ｐ＜０．０１．实验?

p53基因增强恶性胶质瘤HSV-TK/ACV系统疗效的体外研究

目的 :体外研究p5 3基因提高恶性胶质瘤HSV TK/ACV系统自杀基因治疗疗效的可行性。方法 :以腺病毒为载体转导p5 3和HSV TK基因入C6鼠胶质瘤细胞 ,给以不同浓度的ACV ,MTT法监测细胞生存率 ,TUNEL法检测凋亡。评价p5 3基因提高HSV TK/ACV系统治疗胶质瘤的疗效。结果 :p5 3明显提高鼠胶质瘤细胞对HSV TK/ACV的敏感性 ,p5 3联合HSV TK转染C6的ACVID50 (1μg·mL-1)和ID10 0 (10 μg·mL-1)较单独HSV TK转染C6的ACVID50 和ID10 0 提高 10倍 ,并可使C6细胞凋亡增加。结论 :p5 3基因可明显增强胶质瘤HSV

旁观者效应在肝癌基因治疗中的作用

目的 :观察HSV -tk/ACV(HerpesSimplexVirusthymidinekinasegene/Acyclovir)系统基因治疗恶性肿瘤过程中旁观者效应的作用。方法 :HSV -tk基因重组逆转录病毒载体转染PA317细胞为PA317-tk细胞。培养PA317-tk细胞即可获得有感染力的携带HSV -tk基因的病毒颗粒 ,然后转染肝癌细胞株SMMC -772 1细胞为SMMC -tk细胞。SMMC -TK细胞与SMMC - 772 1细胞以不同百分比混合 ,用ACV(10 0ug/ml)培养基培养 ,MTT法检测ACV对各组细胞抑制率 (InhibitRate ,IR) ,根据各组IR与该组SMMC -tk细胞数的百分比值 (IR/SMMC -tk % ,IR/St)的大小判断旁观者效应作用的有无和强弱。结果 :旁观效应试验表明 ,含SMMC -tk细胞 10 % ,2 0 % ,30 % ,4 0 % ,5 0 % ,6 0 % ,70 % ,80 % ,90 % ,10 0 %各组IR/St比值分别为2 .15 ,1.91,1.83,1.4 7,1.30 ,1.11,1.0 2 ,0 .93,0 .84 ,0 .76。 10 %～ 70 %各组IR/St比值均大于 1,存在明显旁观者效应 ,以 10 % ,2 0 % ,30 % ,4 0 %组最强 ,80 %～ 10 0 %三组IR/St比值小于 1,旁观者效应不明显。结论 :研究结果证实用HSV -tk/ACV系统基因治疗恶性肿瘤 ,适宜比例TK+ 细胞时 ,存在明显的旁观者效应 ,TK/细胞为 10 %时旁观者效应最强 ,这对于HSV -TK/ACV系统基因治疗恶性肿瘤具有重要意义。

HSV1-TK、HSV1-SR39TK及GCV、ACV对小鼠T淋巴细胞的杀伤作用研究

目的观察慢病毒载体携带的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)和突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-SR39TK)基因在小鼠T淋巴细胞的表达及前体药物丙氧鸟苷(GCV)、无环鸟苷(ACV)对小鼠T淋巴细胞的杀伤效应。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-TK、HSV1-SR39TK基因分别连接至慢病毒载体,在TK、SR39TK基因后以内部核糖体进入位点(IRES)连接绿色荧光蛋白(GFP)基因,采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A激活的小鼠T淋巴细胞,然后通过CCK-8方法观察其对前体药物GCV、ACV的敏感性。结果慢病毒载体携带的HSV1-TK及HSV1-SR39TK基因均可在小鼠T淋巴细胞内高效表达,GCV和ACV对转导TK基因的淋巴细胞均有杀伤作用,含突变型TK基因的淋巴细胞对前体药物敏感性更高,后者对GCV的IC_(50)值比野生型小2.5倍,对ACV的IC_(50)值比野生型小17.4倍。结论表达HSV1-SR39TK基因的T细胞对GCV有更高的敏感性,对ACV也较敏感,应用HSV1-SR39TK基因进行防治GVHD的研究是更好的选择。

带HSV－tk基因的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的腺病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分裂细胞有很强的杀伤作用．在感染复数（Ｍ．Ｏ．Ｉ，ＭｕｌｔｉＰｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到１００％．四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９，ＬＡＸ，ＳＰＣ，ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的腺病毒（ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ）的杀伤作用表现出不同的敏感性．另Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）和ＧＣＶ对感染了重组腺病毒ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞都有一定杀伤作用，但杀伤效果有很大差别；就Ａ５４９而言，ＧＣＶ的杀伤作用比ＡＣＶ高７～８倍．此外ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ结合ＧＣＶ杀伤肿瘤细胞时有“旁观者效应”，即感染了ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞与未感染细胞混合后，后者也明显地遭到杀伤．

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究

目的检测反转录病毒介导的HSV-tk／ACV系统的安全性。方法DNA聚合酶链式反应（PCR）、反转录PCR（RT／PCR），Southern杂交及neo基因和LacZ基因补救分析：细胞接种、X-gal染色、TK基因PCR和病理切片检查等。结果从DNA、RNA水平和病毒活体水平对产HSV-tk病毒包装细胞（TK／VPC）、C5转TK基因细胞和实验动物血流中未能检测到具有复制能力的野生型反转录病毒（RCR）；PA317／BAG，PA／317／TK产病毒细胞（VPC）于动物体内存活期不超过一个月，未形成肿瘤，无严重炎症反应，HSV-tk／ACV系统及代谢产物无明显毒副作用。结论反转录病毒介导的HSV-tk／ACV系统在动物体内取得了安全的结果。