超广谱β-内酰胺酶SHV-18的表达纯化及活性验证

目的:产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制,该类酶主要水解青霉素类、头孢菌素类以及单环酰胺类抗生素。自从1983年第一次有关β内酰胺酶的报道开始,至今已经发现超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的种类超过400种,其中SHV型是最常见的ESBLs类型之一。本研究主要探讨了超广谱β-内酰胺酶SHV-18的原核表达载体的构建、酶的纯化和活性验证。方法:利用肺炎克雷伯菌ATCC700603全基因组为模板,应用分子生物学技术钓取SHV-18基因,构建pET22b(+)-SHV-18表达质粒,经测序鉴定后,转化大肠杆菌Transetta(DE3),IPTG诱导表达并亲和纯化,进一步通过抗生素水解实验,检测其水解活性,测定其酶动力学参数。结果:成功构建了可以以裂解上清形式高效表达SHV-18的工程菌。通过亲和纯化最终获得纯度达到90%以上的β-内酰胺酶SHV-18。获得的SHV-18蛋白能够水解青霉素G、头孢拉定、头孢唑肟、头孢他啶、头孢吡肟等多个抗生素。结论:获得了对青霉素和头孢菌素类具有水解活性的超广谱β-内酰胺酶SHV-18,并对其酶动力学参数进行了检测。在实验室研究了β-内酰胺酶SHV-18对不同抗生素的水解特性,更加有利与指导临床抗生素的合理使用。