sidt2基因敲除小鼠对肝脂类物质代谢的影响

目的:使用sidt2基因敲除小鼠模型来研究sidt2在肝脂类物质代谢中的作用.方法:用Cre/LoxP技术制作小鼠模型,采用RT-PCR技术检测sidt2的mRNA表达,蛋白印迹分析其蛋白的组织分布.与野生型小鼠相比,用酶法来分析sidt2-/-小鼠血清脂类物质、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶和血清胆红素等的变化.结果:通过sidt2的基因鉴定,获得基因敲除小鼠,并且发现sidt2-/-小鼠肝功能和脂类物质代谢异常.结论:缺乏溶酶体膜蛋白sidt2会导致肝功能和脂类物质代谢发生异常.

溶酶体膜蛋白sidt2介导肝脏细胞的凋亡:不通过抑制自噬溶酶体途径

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察Sidt2对肝脏细胞增殖活性和凋亡的影响,并且使用0、10、25、50、100、200μmol/L的氯喹(CQ)摸索肝脏细胞CQ饱和浓度,检测对其自噬流的影响,以及使用CQ进一步探索影响肝脏细胞的增殖活性其凋亡水平的机制。结果成功构建HL7702细胞Sidt2+/+组及Sidt2-/-组。Sidt2基因缺失可导致肝脏细胞增殖被抑制和凋亡水平的增加,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62在蛋白水平上的表达均增加且自噬体含量增加(P<0.05)。结果显示50μmol/LCQ作用下肝脏细胞自噬达到饱和状态,50μmol/L CQ使Sidt2基因缺失时LC3B和P62的表达均增加(P<0.05),且CQ进一步降低肝脏细胞活性,并促进其凋亡水平(P<0.05)。结论在离体水平上,Sidt2基因剔除后,HL7702细胞可表现自噬通路的异常,并且不通过抑制自噬溶酶体途径介导和调控凋亡。

溶酶体膜蛋白Sidt2对血糖代谢的影响

目的:通过模式动物研究溶酶体膜蛋白Sidt2与糖代谢的关系。方法:利用Lox P-Flox-Lox P系统,通过基因重组及打靶技术获得Sidt2剔除小鼠模型。检测成年小鼠的空腹血糖及葡萄糖耐量,评估Sidt2基因剔除对小鼠糖代谢的影响。同时通过HE染色观察Sidt2-/-小鼠胰岛形态结构改变。结果:通过对Sidt2剔除模型小鼠的Sidt2 mRNA及蛋白水平鉴定,确定Sidt2基因剔除小鼠模型成功构建。对小鼠末梢血糖检测发现,Sidt2-/-成年小鼠表现出空腹血糖增高及糖耐量受损的糖尿病表现。对Sidt2-/-小鼠胰岛形态检测发现,其胰岛出现结构紊乱,胰岛空泡变性及部分细胞出现肥大等病理改变。结论:溶酶体膜蛋白Sidt2与糖代谢密切相关。

Sidt2基因剔除小鼠的肺部形态学改变

目的:观察Sidt2基因剔除小鼠的肺组织超微结构,探讨Sidt2基因在肺脏形态发育过程中的作用。方法:将利用基因打靶及同源重组技术获得的Sidt2基因全身剔除小鼠和野生型B129品系小鼠合笼交配,鼠尾提取DNA进行基因型鉴定,挑选出子代Sidt2-/+小鼠,同笼交配,再挑选出子代Sidt2-/-小鼠为实验组,以同窝野生型小鼠为对照,进行DNA、RNA和Western鉴定,并行肺组织光镜和电镜形态学观察。结果:通过DNA、RNA、蛋白质水平验证模型构造成功。光镜下对照鼠肺泡壁光滑,仅有少量粒细胞浸润;模型鼠肺泡间质内毛细血管扩张、充血,多处炎症细胞呈灶状分布。电镜下对照鼠的肺组织形态较规则;模型鼠可见肺泡上皮细胞崩解,毛细血管充血及基底膜增厚。结论:Sidt2基因剔除可影响小鼠肺组织形态,表现为细胞坏死,毛细血管充血及基底膜增厚,大量炎症细胞浸润,造成肺损伤。

稳定表达人SidT2基因细胞系的建立及其dsRNA转运功能的研究

目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及MDCK细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及MDCK细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、MDCK细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。

溶酶体膜蛋白Sidt2缺失导致肝脏细胞自噬受损

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62进行共定位,检测自噬小体对P62货物蛋白的识别与封存以及自噬溶酶体的降解。对LC3B及LAMP1进行免疫荧光共定位,检测自噬小体与溶酶体融合过程。使用LysoTracker对酸性溶酶体进行示踪。结果成功构建HL7702细胞Sidt2^(+/+)组及Sidt2^(-/-)组,HL7702细胞Sidt2^(-/-)组较Sidt2^(+/+)组相比,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62表达均增多(P<0.01),免疫荧光结果显示LC3B及P62亦明显增多(P<0.001),同时自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12表达减少(P<0.05)。LC3B与P62共定位降低,LC3B与LAMP1共定位降低,酸性溶酶体数量减少(P<0.05)。结论Sidt2基因的缺失导致人肝脏细胞自噬小体对P62货物蛋白的识别和封存障碍,同时酸性溶酶体数量减少、自噬小体与溶酶体融合障碍导致自噬溶酶体途径受阻,最终导致LC3B与P62发生堆积,肝脏细胞自噬受损。

利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150V,脉冲时间5ms,脉冲间隔50ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。

小鼠sidt2基因的可变剪接验证

目的:验证小鼠基因sidt2中sidt2(l)和sidt2(s)为同一基因经可变剪接所得的结果。方法:对小鼠sidt2基因进行生物信息学分析及基因组PCR,确定其基因组定位情况;通过提取总RNA、RT-PCR,了解sidt2在小鼠多种组织中的表达情况;构建可变剪接报告载体,转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6,并提取细胞总RNA、RT-PCR,检测其在细胞中的剪接行为,验证该基因存在可变剪接。结果及结论:证实小鼠sidt2存在可变剪接,其两条序列sidt2(l)和sidt2(s)为可变剪接的产物。

外显子组测序探究原发性干燥综合征相关基因

目的探究编码区变异在原发性干燥综合征遗传机制中的作用。方法对11例pSS患者和6例健康对照进行全外显子测序,经过位点的多重过滤筛选、基因的功能分析和变异位点的有害性分析获得与疾病相关的变异位点。结果经过筛选分析获得2个变异位点:IFIH1 c.2115A>C和SIDT1 c.1216G>A,Sanger测序证实为患者样本中真实存在的变异。结论IFIH1c.2115A>C和SIDT1 c.1216G>A可能与原发性干燥综合征存在相关性。

牛结核体外免疫诊断技术

牛分支杆菌感染的主要特征是引起细胞内免疫反应。现在针对牛结核的诊断试验是以T细胞反应机制为基础的。低敏感性的结核血清学试验是不值得提倡的,血清学试验最好作为细胞学试验的补充而不是替代。最近,发现了牛结核r干扰素试验是一种快速的(24小时)惟一使用全血的体外试验,该方法在澳大利亚地区应用发现,该方法要比传统的结核菌素法诊断牛结核更敏感。假阳性反应的难题归因于所使用的抗原制品间的交叉反应特性,设动物对牛PPD和禽PPD的r干扰素反应作对照可解决假阳性的问题。虽然牛结核特异性蛋白已确认并被分类,这些特异性蛋白可能在血清学或细胞学诊断试验中使用,但是它们可能因牛对结核分支杆菌感染的免疫反应的遗传多样性而受到限制。

普通低碳钢通过应变感生动态转变形成超细铁素体

最近几年，通过在较宽温度范围施加大变形量来生产超细晶粒铁素体钢，已成为全世界关注的重点。奥氏体应变感生动态转变(SIDT)是生产超细铁素体晶粒钢的一个比较好的方法。

小肠减压管联合泛影葡胺在术后早期炎性肠梗阻治疗中的作用

目的评价经鼻置入小肠减压管行小肠减压、并注入泛影葡胺行小肠造影在术后早期炎性肠梗阻治疗中的作用。方法首都医科大学附属北京同仁医院普通外科于2011年4月至2012年7月间有12例腹部手术患者术后早期出现炎性肠梗阻，经鼻胃管减压等常规保守治疗2周后，肠梗阻症状改善不明显，遂经鼻置人小肠减压管行小肠减压，同时经减压管注入泛影葡胺行小肠造影，了解小肠蠕动情况及肠道梗阻情况，并利用泛影葡胺促进肠蠕动的治疗作用，观察其治疗效果。结果在置入小肠减压管后，12例患者腹胀症状均有所缓解，其中11例在置入小肠减压管后3周内腹部坚韧感消失，恢复正常排气并逐渐开始经口进食；1例患者在50d后仍未排气，再次行手术治疗，术后3d患者恢复自主排气。随访6个月，全组患者无一例复发肠梗阻。结论对于症状较重、病程较长并经常规处理无效的术后早期炎性肠梗阻患者，应用小肠减压管行小肠减压并注入泛影葡胺行小肠造影的方法安全有效，能够避免二次手术。