siRNA沉默Drp1对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响

目的探究siRNA沉默动力相关蛋白1(Drp1)后对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬以及细胞凋亡的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,用1μm、5μm、10μm、20μm鱼藤酮进行处理24 h、48 h,MTT法检测细胞抑制情况。将细胞分为鱼藤酮最佳浓度处理组(20μm鱼藤酮处理,损伤组)、阴性转染组(损伤组基础上转染Drp1阴性序列)、Drp1siRNA处理组(损伤组基础上转染Drp1 siRNA)、Drp1抑制剂组(损伤组基础上添加Mdivi-1试剂)、自噬促进剂组(损伤组基础上添加雷帕霉素)。观察各组线粒体自噬情况、细胞线粒体功能相关蛋白(Mfn2、Drp1、NRF1)、自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)、凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况和细胞凋亡情况。结果与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞抑制率均升高,随着浓度以及培养时间的增加,细胞抑制率逐渐增加(P<0.05)。损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组LC3II定位在细胞线粒体,且细胞线粒体结构受损,外周出现自噬双层膜。与Drp1 siRNA转染组、Drp1抑制剂组相比,损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组Drp1、LC3II、Beclin-1、Bax蛋白表达和细胞凋亡率升高,Mfn2、NRF1、P62、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Drp1参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬,沉默Drp1后可降低鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬以及细胞凋亡,具有保护作用。

siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达水平及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响

目的分析胰腺癌BXPC-3细胞中原癌基因人表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)基因siRNA沉默对环氧合酶-2(COX-2)表达水平及其对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法通过Western blot法与实时荧光定量PCR法对正常胰腺细胞株和胰腺癌BXPC-3细胞中的COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达进行检测。建立Her-2/neu基因siRNA慢病毒表达载体并对BXPC-3细胞进行转染,其中转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体为观察组,转染NC-GFP-LV为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。分别采用CCK-8法、流式细胞分析仪和细胞实验技术(Transwell实验)分析Her-2/neu基因siRNA沉默对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。结果 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中的表达水平明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞的表达(P<0.01)。观察组COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达水平明显下调,较阴性对照组与空白对照组表达水平均明显降低(P<0.01),而阴性对照组与空白对照组表达水平的比较,并无显著差异(P>0.05)。Her-2/neu基因siRNA沉默可明显减弱细胞增殖和侵袭力,增加细胞凋亡率。结论 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中均呈现高表达,且Her-2/neu基因siRNA沉默可明显阻滞细胞增殖及侵袭,导致细胞凋亡。

siRNA沉默BRM增强胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性的作用机制研究

目的:探讨siRNA沉默BRM增强胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性的作用。方法:体外培养人胰腺癌Panc-1细胞,将阴性对照NC和BRM siRNA转染到Panc-1细胞,用RT-PCR和Western Blot法检测Panc-1细胞BRM的表达,以鉴定BRM特异性siRNA沉默效果。用不同浓度的吉西他滨进行干预,检测细胞增殖率,计算半数抑制浓度(IC50),同时检测Panc-1细胞凋亡率和Panc-1细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3和Survivin蛋白表达水平。结果: BRM siRNA组Panc-1细胞中BRM mRNA和蛋白表达较空白对照组和NC对照组显著降低(P<0.05);BRM siRNA组吉西他滨对Panc-1细胞增殖的抑制较空白对照组和NC对照组增强(P<0.05),通过计算,空白对照组、NC对照组和BRM siRNA组的IC50分别为5.18ug/mL、5.05ug/mL和3.05ug/mL;给予终浓度为3.0ug/mL的吉西他滨干预,BRM siRNA组Panc-1细胞凋亡率较空白对照组和NC对照组显著增高(P<0.05),STAT3变化不显著(P>0.05),JAK2、p-STAT3和Survivin蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:通过siRNA沉默BRM的表达后可以增加Panc-1细胞对西他滨的敏感性,可能与BRM激活JAK2/STAT3通路促进胰腺癌生长和耐药有关。

SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞情况对放疗敏感性的影响

目的使用SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞,分析转染情况对细胞活性及放疗敏感性的影响。方法使用SiRNA转染液对MDA-MB231细胞进行转染,采用Western blot法筛选,根据转染结果分为空白组(没有转染)、阴性组(转染后未测出MDA-MB231/siRNA序列)、阳性1组(转染后测出MDA-MB231/siRNA1序列)、阳性2组(转染后测出MDA-MB231/siRNA2序列)、阳性3组(转染后测出MDA-MB231/siRNA3序列),每组60孔。每组细胞又细分为3个小组,每个小组20孔板,分别接受3个梯度(2 mV、4 mV、8 mV)X线的单次照射。比较5组MDA-MB231细胞增殖率、凋亡率、放疗敏感性蛋白含量(p38、p-p38、Cleaved Caspase-3)的差异。结果5组MDA-MB231细胞增殖率和凋亡率差异均明显(P<0.05),两两比较,阳性1组、阳性2组、阳性3组与空白组(或阴性组)间差异有统计学意义(P<0.05);X线进行细胞照射的剂量越高,细胞增殖率越低(P<0.05)、凋亡率越高(P<0.05);3个阳性组分别与空白组(或阴性组)比较,p-p38、Cleaved Caspase-3蛋白表达含量的差异有统计学意义(P<0.05),阳性组细胞表达含量相对较高。结论SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞可降低细胞增殖率、提高细胞凋亡率,测出siRNA3序列的MDA-MB231细胞尤为明显;细胞放疗敏感性的差异可能与耐药蛋白的产生有关。

C5-siRNA沉默补体C5对大鼠心肌缺血损伤影响的病理学研究

目的探讨小分子干扰RNA片段(siRNA)沉默补体C5表达对大鼠的缺血心肌组织病理学的影响。方法 30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组),心肌缺血组(Ischemia组)和C5-siRNA干预组。假手术组及心肌缺血组的大鼠冠状动脉左前降支支配区注入生理盐水(100μl/kg),C5-siRNA干预组大鼠冠脉左前降支支配区注入C5-siRNA(100μl/kg),实验结束后测定鼠的心脏指数和左心室重量指数,光镜下观察鼠心肌形态学改变及C5的免疫组织化学染色结果。结果缺血4 h后,检测3组之间的心脏指数和左心室重量指数无统计学意义的差别(P>0.05)。光镜下见干预组鼠心肌组织水肿、变性较心肌缺血组轻,心肌间质可出现少量红细胞。C5的免疫组织化学结果显示,Ischemia组与干预组的C5表达量均明显高于Sham组(P<0.001),而干预组的C5表达量虽与Ischemia组相比有所降低,但二者没有统计学意义的差别(P=0.132)。结论 C5-siRNA减轻心肌缺血的病理学损伤及降低心肌C5表达。

siRNA沉默TRIM65基因对脑胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡及STAT3信号通路的影响

目的探讨siRNA沉默三结构域蛋白65(TRIM65)基因对脑胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡及STAT3信号通路的影响。方法采用qRT-PCR、Western Blot检测TRIM65在正常脑胶质细胞HEB及胶质瘤细胞株U251、TJ861、A172中的表达;转染siRNA NC、siRNA TRIM65,STAT3信号通路激活剂SD19处理胶质瘤细胞株U251,采用MTT法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果与正常脑胶质细胞HEB比较,胶质瘤细胞株U251、TJ861、A172中TRIM65的mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05)。与siRNA NC组比较,siRNA TRIM65组U251细胞24、48、72 h增殖抑制率、凋亡率显著升高(P<0.05),侵袭和迁移数目显著降低(P<0.05);U251细胞中TRIM65、cyclin D1、MMP-2、p-Jak2、p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05),Caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)。与siRNA TRIM65组比较,siRNA TRIM65+SD19组U251细胞中p-Jak2、p-STAT3蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论siRNA沉默TRIM65基因表达可降低脑胶质瘤细胞增殖率、侵袭和迁移能力,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与调控STAT3信号通路有关。

siRNA靶向沉默MALAT-1对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及PI3K/ATK通路的影响

目的:探究siRNA靶向沉默MALAT-1对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响。方法:分别以10、20、30、40、50 nmol/L浓度的siRNA靶向沉默体外培养的人鼻咽癌细胞株CNE的基因MALAT-1,以实时荧光定量(qRT-PCR)分别在24、48 h后检测MALAT-1 mRNA表达水平,筛选合适的siRNA作用浓度和时间。将CNE细胞分为三组:空白对照组、siRNA阴性对照组和siRNA组,siRNA处理细胞后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况,采用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3)及PI3K/AKT通路蛋白(PI3K、ATK、p-AKT)表达情况。结果:选定30 nmol/L浓度的siRNA作用于CNE细胞48 h;siRNA处理细胞后,与空白对照组相比,siRNA组细胞增殖率明显降低,凋亡率明显升高,Bax、caspase-3蛋白表达明显升高,Bcl-2、PI3K、p-AKT蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);AKT蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。siRNA阴性对照组各指标均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:siRNA可靶向沉默MALAT-1,抑制鼻咽癌细胞增殖,促进其凋亡,可能是通过抑制PI3K/AKT通路实现的。

基因沉默RhoC联合雷帕霉素对肝癌细胞侵袭和转移影响的实验研究

目的:通过基因沉默RhoC联合雷帕霉素阻断mTOR通路对肝癌细胞侵袭和转移影响的实验研究,证明二者联合能显著抑制肝癌侵袭、迁移,寻找治疗肝癌的新分子靶点。方法:RhoC-siRNA质粒转染BEL7402细胞,荧光显微镜检测转染效率;Western blot方法鉴定RhoC的基因沉默效果。实验分为6组:空白对照BEL7402组、阴性对照Scramble-siRNA组、阴性对照Scramble-siRNA+Rapa组、Rapa组、RhoC-siRNA组、RhoC-siRNA+Rapa组。采用半定量RT-PCR法检测侵袭相关因子MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、P27RF-Rho以及凋亡相关因子Survivin表达;免疫细胞化学法检测MMP2、MMP9的表达;采用划痕实验,细胞黏附实验,Transwell小室检测细胞的侵袭转移。结果:Scramble-siRNA+Rapa组、Rapa组、RhoC-siRNA组MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、p27RF-Rho、Survivin和空白对照BEL7402组、阴性对照Scramble-siRNA组比较表达降低(P<0.05),RhoC-siRNA联合Rapa组的表达显著降低(P<0.01);Scramble-siRNA+Rapa组、Rapa组、RhoC-siRNA组抑制肝癌细胞侵袭和迁移(P<0.05),而RhoC-siRNA联合Rapa组显著抑制肝癌细胞的侵袭迁移(P<0.01)。结论:RhoC-siRNA联合雷帕霉素能显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭,是治疗肝癌的良好分子靶点。

Survivin、Livin和NF-kB在大肠癌中的表达及影响探究

探讨大肠癌组织中Survivin,Livin和NF-kB的表达以及大肠癌细胞HT29增殖和凋亡受到siRNA沉默Survivin基因的影响。方法:回顾性选取2020年2月-2022年2月本院慢性肠炎组织50例、大肠癌(临床上无转移)组织50例,转移性大肠癌组织50例以上,共150例。统计分析慢性肠炎组织和大肠癌组织中Survivin,Livin和NF-kB表达,分析大肠癌组织中Survivin,Livin表达和临床病理特征的相关性,并统计分析Survivin-siRNA转染后1 d、2 d、3 d增殖抑制率及Survivin-siRNA转染后凋亡比例。结果 大肠癌组织中Survivin,Livin和NF-kB表达阳性率均高于慢性肠炎组织(P<0.05)。突破肌层患者大肠癌组织中Survivin,Livin表达阳性率高于未突破肌层患者(P<0.05),有淋巴结转移患者大肠癌组织中Survivin,Livin表达阳性率高于无淋巴结转移患者(P<0.05),Duke’s分期C+D期患者大肠癌组织中Survivin,Livin表达阳性率高于A+B期患者(P<0.05)。空白组、阴性对照组、Survivin-siRNA组、5-Fu 24 h组患者Survivin-siRNA转染后1 d、2 d、3 d增殖抑制率均逐渐升高(P<0.05),Survivin-siRNA转染后M1值逐渐升高(P<0.05)。结论 大肠癌组织中Survivin,Livin和NF-kB的表达阳性率高,大肠癌细胞HT29增殖和凋亡分别受到siRNA沉默Survivin基因的抑制和促进。

人脂肪源性间充质干细胞修复放化疗所致胸腺损伤机制研究

目的观察体外人脂肪源性间充质干细胞对放化疗损伤胸腺上皮细胞增殖作用并进行机制探索。方法无菌环境下分离提取人脂肪源性间充质干细胞;以20、30、50及100μmol/L KGF-si RNA作用于脂肪源间充质干细胞,筛选最佳KGF-siRNA基因沉默作用浓度;比较KGF基因沉默干预与非KGF基因沉默干预对胸腺上皮增殖影响。结果人脂肪源性间充质干细胞培养6~8 d呈典型纤维状,流式细胞检测细胞表面抗原CD44阳性93.7%,CD34阳性率0.405%。不同浓度20、30、50及100μmol/L的KGF-siRNA转染作用48 h后人脂肪源间充质干细胞mRNA水平下降33.22%、46.40%、81.06%及42.35%,50μmol/L作用48 h效果明显,差异有统计学意义(P<0.05)。48 h基因沉默组、空白对照组及空质粒组角质细胞生长因子表达发现沉默组与空白对照及空质粒组存在显著差异(P<0.05),后二者间无显著差异(P>0.05)。应用Brdu增殖实验连续3 d分别测定基因沉默组、正常组、单纯人胸腺上皮细胞增殖情况及基因沉默组、正常组及单纯鼠胸腺上皮细胞增殖情况发现基因正常组显著高于基因干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。应用PI单染测定基因沉默组、正常组、单纯人胸腺上皮细胞及基因沉默组、正常组、单纯鼠胸腺上皮细胞周期计算细胞增殖密切相关S期细胞所占比,证实正常对照组增殖显著高于况默组及单纯小鼠胸腺上皮细胞组增殖,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论脂肪源性间充质干细胞可通过分泌角质细胞生长因子完成胸腺上皮细胞增殖;脂肪源性间充质干细胞对放化疗损伤胸腺有促进修复的作用。

新型PEI衍生物对基因沉默作用的研究

目的:构建出一种新型的高效的非病毒基因输送材料。方法:利用1,4-丁二醇二氯甲酸酯连接小分子PEI,合成新型的PEI衍生物(dPEI),通过体外COS-7和HSC细胞实验检测其对质粒和siRNA的输送情况。结果;COS-7细胞实验显示,dPEI具有高效输送质粒的能力,其转染效率是对照组PEI25kDa的10倍以上;同时,HSC细胞实验进一步证实dPEI包裹siRNA转染具有一定的基因沉默作用。结论:本研究合成的新型PEI衍生物既可以用于质粒基因的转染,也可用于siRNA的转染,是一种新型的高效的非毒基因输送材料。

amiRNAi-实现高效稳定的特异基因沉默新方法

RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)是实现基因沉默的有效工具。近年来,随着分子生物学与生物技术的快速发展,在RNAi基础上又发展出另一种特异性更高的基因沉默技术—amiRNAi(artificial microRNA interference)。amiRNAs是一类由内源miRNA前体生成的长21个核苷酸的人工小RNA分子,它能在不影响其他基因表达的情况下特异地介导单个或多个靶基因高效稳定沉默。与普通的RNAi相比,amiRNAi具有特异性高、稳定性强和沉默效应可预见等优点。因而amiRNAi可能成为基因功能分析的最有效工具之一,同时amiRNAi对于基因负调控研究和应用而言前景广阔。着重介绍了amiRNAi技术的原理、优势及其潜在的应用价值。

SIRT2抑制对MPP^(+)诱导的帕金森病细胞模型凋亡和线粒体动态平衡的影响

探究siRNA敲减沉默信息调节因子2(SIRT2)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导的帕金森病细胞模型细胞损伤的影响和机制。CCK-8法检测不同浓度MPP+处理对体外培养小鼠海马神经元HT-22细胞生存率的影响。将细胞分为对照组、MPP^(+)最佳浓度处理组(1mmol/LMPP+处理组)、阴性转染组(对照组基础上转染SIRT2阴性序列)、SIRT2siRNA处理组(损伤组基础上转染SIRT2siRNA)。观察各组细胞凋亡情况,检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-9)、线粒体分裂及融合相关蛋白(Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2)。与对照组相比,MPP+处理组细胞抑制率均升高,细胞抑制率随MPP+浓度增加而逐渐增加(P<0.05)。与SIRT2siRNA转染组相比,损伤组Bax、Caspase-9、Drp1、Fis1蛋白表达和细胞凋亡率升高,Bcl-2、Mfn1、Mfn2蛋白表达降低(P<0.05)。SIRT2在MPP+诱导帕金森病细胞模型中表达升高,抑制SIRT2可减轻MPP+诱导帕金森病细胞模型中细胞凋亡并促进线粒体融合,从而对神经元具有一定的保护作用。