非瑟酮调节LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K通路改善大鼠少弱精子症

目的研究非瑟酮对少弱精子大鼠的睾丸及精子保护作用,并探究其机制。方法构建大鼠少弱精子模型,将大鼠随机分为空白组、模型组、非瑟酮低、中、高剂量治疗组、LKB1激动剂组,每组各10只。ELISA法检测各组卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinising hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)、催乳素(prolactin,PRL)水平;流式细胞术检测精子细胞凋亡;HE染色检测大鼠睾丸组织损伤;透射电镜检测精子细胞超微结构;qRT-PCR和Western blot检测LKB1、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达。结果与空白组相比,模型组和LKB1激动剂组FSH、LH、PRL、T等激素水平明显降低,精子细胞出现凋亡,睾丸损伤严重,LKB1、p-AMPK/AMPK表达明显上调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达下调(P<0.05);与模型组相比,不同剂量的非瑟酮治疗后,精子细胞凋亡数明显减少,FSH、LH、PRL、T等激素水平明显上升,LKB1、p-AMPK/AMPK明显下调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K明显上调(P<0.05)。结论非瑟酮可有效治疗少弱精症大鼠,其作用机制可能与LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K信号通路有关。

胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬的研究

目的:研究胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬,发挥其抗肺癌作用的机制。方法:MTT法检测胡桃醌对A549细胞存活率的影响。透射电镜和细胞自噬染色检测试剂盒(MDC)观察胡桃醌诱导A549细胞自噬。蛋白免疫印迹法检测自噬标志蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和LC3I蛋白和自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K相关蛋白的表达水平。RT-PCR法检测A549细胞中Beclin-1和LC3ⅡmRNA表达水平。结果:MTT结果表明胡桃醌抑制A549细胞增殖,IC 50=10μmol/L;透射电镜和MDC实验发现胡桃醌可以诱导A549细胞产生自噬;与对照组相比,胡桃醌可以显著增加Beclin-1蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3I比值和Beclin-1、LC3ⅡmRNA表达水平(P<0.05,P<0.01);胡桃醌干预后,与对照组相比,Akt、mTOR和p70S6K蛋白的表达水平基本不变,但Akt、mTOR和p70S6K磷酸化蛋白的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:胡桃醌可能通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬。

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

利多卡因通过调控miR-520a/AKT/mTOR/p70S6K通路对SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的探讨利多卡因通过调控自噬对神经毒性的影响及相关分子机制。方法培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,MTT实验和乳酸脱氢酶(LDH)测定检测利多卡因对SH-SY5Y细胞活力和毒性的影响;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-520a的相对表达;Western blot检测利多卡因对AKT/mTOR/p70S6K通路相关蛋白和自噬相关蛋白的影响;细胞免疫荧光染色评估LC3B的表达;生物信息学预测AKT1是miR-520a的潜在靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-520a和AKT1之间的相互作用。结果与对照组比较,SH-SY5Y细胞活力受到明显的抑制,且呈时间和剂量依赖性,LDH的释放量随利多卡因剂量增多而增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达显著升高,p62蛋白表达显著降低,LC3B的荧光强度显著增强,miR-520a的表达显著增加,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与NC inhibitor组比较,miR-520ainhibitor组WT-AKT1的荧光素酶活性显著升高(P<0.05),而MUT-AKT1的荧光素酶活性没有变化(P>0.05)。与利多卡因组+NC inhibitor组比较,利多卡因+miR-520a inhibitor组SH-SY5Y细胞中miR-520a水平降低,LDH的释放量显著降低,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达显著降低,p62蛋白表达显著升高,LC3B的荧光强度显著降低(P<0.05)。结论利多卡因通过上调miR-520a的表达和抑制AKT/mTOR/p70S6K信号通路促进神经细胞自噬。

脑苷肌肽对缺氧缺血性脑病新生大鼠SIRT1/mTOR/p70S6K通路及神经元凋亡的影响

目的探讨脑苷肌肽对缺氧缺血性脑病(HIE)新生大鼠沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)通路及神经元凋亡的影响。方法采用结扎左侧颈总动脉及缺氧玻璃仓的方法建立新生大鼠HIE模型,造模大鼠随机分为5组:模型组、脑苷肌肽低剂量组(0.8 mg/kg)、脑苷肌肽中剂量组(1.6 mg/kg)、脑苷肌肽高剂量组(3.2 mg/kg)、尼莫地平组(10 mg/kg),每组12只,另取12只设为假手术组。分组处理后,观察各组大鼠神经行为活动并进行评分;测定各组大鼠脑组织含水量;TUNEL染色检测各组大鼠脑皮质神经元凋亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;免疫印迹法检测各组大鼠脑组织SIRT1/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达情况。结果与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑皮质神经元凋亡率、血清TNF-α及IL-1β水平、脑组织SIRT1/mTOR/p70S6K通路相关蛋白p-mTOR/mTOR及p-p70S6K/p70S6K明显升高,脑组织SIRT1表达降低(P<0.001);与模型组相比,脑苷肌肽低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑皮质神经元凋亡率、血清TNF-α及IL-1β水平、脑组织SIRT1/mTOR/p70S6K通路蛋白p-mTOR/mTOR及p-p70S6K/p70S6K降低,脑组织SIRT1表达升高(P<0.001),且脑苷肌肽各组呈剂量依赖性(P<0.001),脑苷肌肽高剂量组与尼莫地平组相比,大鼠各指标差异无统计学意义。结论脑苷肌肽可促使HIE新生大鼠脑组织SIRT1表达,降低mTOR、p70S6K磷酸化水平,抑制炎症,减轻脑水肿及神经元凋亡,修复神经功能,改善其临床症状。

欧前胡素调节MAPK/mTOR/p70S6K信号通路对急性髓系白血病细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨欧前胡素(IMP)对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学行为的影响以及对MAPK/mTOR/p70S6K信号通路的调节机制。方法将人AML细胞HL-60进行培养传代,并分为对照组(未处理组),ERK抑制剂组(PD98059组),IMP低、中、高剂量组,IMP高剂量+ERK激活剂组(IMP高+Cearoin组),每组均设置6个重复。MTT法检测IMP对HL-60细胞的毒性;MTT法、软琼脂克隆形成实验检测HL-60细胞的增殖活性;流式细胞仪术检测HL-60细胞凋亡;Transwell小室检测HL-60细胞迁移和侵袭能力;ELISA检测HL-60细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;Western blot检测通路相关蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达。结果与未处理组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组HL-60细胞的存活率、克隆形成数量、迁移和侵袭数量、促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及ERK1/2、mTOR、p70S6K磷酸化水平、Bcl-2表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ显著升高(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组中ERK激活剂明显消除了IMP对上述指标的影响(P<0.05)。结论IMP可能通过抑制MAPK/mTOR/p70S6K信号通路,抑制AML细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞自噬和凋亡。

人参皂苷Rb1抗小鼠脑自然衰老及其对mTOR/p70S6K通路的影响

【目的】观察人参皂苷Rb1对小鼠脑组织自然衰老的作用,并探讨mTOR/p70S6K通路在其中的作用。【方法】27只C57/B6雌性小鼠购于中山大学实验动物中心,其中7只3月龄C57/B6雌性小鼠为青年组,20只22月龄C57/B6雌性小鼠为老年组,青年组小鼠予生理盐水(PBS)腹腔注射,老年组小鼠分别予PBS(对照)、低剂量Rb1(10 mg·kg-1·d-1)、高剂量Rb1(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射。6周后处死小鼠,取脑组织匀浆,检测丙二醛(MDA)含量、单胺氧化酶(MAO)活性,western blot技术检测血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、p-m TOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白表达情况。【结果】与青年小鼠比较,老年对照组小鼠脑组织中的MDA含量增多,MAO活性增加,PAI-1蛋白表达增多,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平增加。与老年对照组比较,注射Rb1的两组小鼠脑组织MAO活性,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平均降低;此外,高剂量Rb1组MDA含量、PAI-1蛋白的表达降低。【结论】高剂量(20 mg·kg-1·d-1)人参皂苷Rb1可以减轻小鼠脑自然衰老;人参皂苷Rb1的这一抗衰老作用可能与m TOR/p70S6K通路密切相关。

miR-381-3p靶向特异性蛋白1抑制mTOR/p70s6k信号通路调控食管癌细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR-381-3p靶向特异性蛋白1(SP1)抑制mTOR/p70s6k信号通路对食管癌细胞的增殖和凋亡调控作用。方法RT-qPCR检测正常食管细胞和食管癌细胞中miR-381-3p与SP1mRNA的表达;利用Lipofectamine 2000将miR-381-3p mimic、miR-control、SP1质粒分别或联合转染进入EC9706细胞,基因预测软件预测miR-381-3p的靶基因,双荧光素酶报告检测靶向关系;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹技术检测Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、p70s6激酶(p70s6k)、p-p70s6k和SP1蛋白表达水平。结果miR-381-3p在食管癌细胞EC9706中低表达(P<0.01),而SP1高表达(P<0.01);miR-381-3p与SP13′UTR区存在结合位点,且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表达;过表达miR-381-3p后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),Ki67和PCNA蛋白表达明显下调(P<0.01),细胞凋亡率明显降升高(P<0.01),Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.01),mTOR和p70s6k磷酸化明显减少(P<0.01);而高表达SP1可以逆转miR-381-3p对食管癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。抑制mTOR/p70s6k信号通路后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),增殖标记蛋白Ki67表达明显下调(P<0.01),凋亡标记蛋白cleaved caspase-3表达明显上调(P<0.01),而SP1蛋白表达无明显变化。结论miR-381-3p可能通过靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信号通路来抑制食管癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡。

沉默YAP1可能通过调控mTOR/p70s6k信号通路对卵巢癌细胞生长和转移的影响

目的探讨Yes相关蛋白1(YAP1)可能通过调控mTOR/p70s6k信号通路对卵巢癌细胞生长和转移的影响。方法以卵巢癌细胞SKOV3为研究对象,将细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-YAP1组(转染si-YAP1)和si-YAP1+3-BDO组(转染si-YAP1后,加入100μmol/L的mTOR通路激活剂3-BDO)。然后采用qRT-PCR检测YAP1 mRNA的表达量;CCK8检测细胞活力;Western blot检测YAP1、Ki67、E-cadherin、N-cadherin和mTOR/p70s6k通路相关蛋白的表达;Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果si-YAP1组的YAP1 mRNA和蛋白表达、细胞活力、Ki67蛋白表达、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、N-cadherin蛋白表达、p-mTOR蛋白表达、p-p70s6k蛋白表达明显低于si-NC组,E-cadherin蛋白表达明显高于si-NC组。si-YAP1+3-BDO组的p-mTOR蛋白表达、p-p70s6k蛋白表达、细胞活力、Ki67蛋白表达、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、N-cadherin蛋白表达明显高于si-YAP1组,E-cadherin蛋白表达明显低于si-YAP1组。结论沉默YAP1可能通过激活mTOR/p70s6k信号通路促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制研究

目的探讨miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制。方法采用人宫颈癌HeLa细胞株构建宫颈癌大鼠模型,分为Gg组(宫颈癌大鼠)、Gm组(注射miR-10b-mimics)、Gi组(注射miR-10b-inhibitions)。采用HE染色观察癌组织变化,Western blotting、RT-PCR检测mTOR/P70S6K的mRNA和蛋白表达水平,Transwell检测HeLa细胞的侵袭能力。结果Gg组肿瘤组织出现丰富的血供,界限分明,切面呈鱼肉状,肿瘤细胞大小较为均等;Gm组肿瘤组织中有大量纤维血管形成,肿瘤细胞大小不等,胞浆着色较深;Gi组肿瘤组织中纤维血管较少,胞浆着色稍浅。Western blotting结果显示,mTOR/P70S6K蛋白表达水平为Gm组<Gg组<Gi组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,mTOR/P70S6K mRNA水平为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05),miR-10b mRNA水平为Gi组<Gg组<Gm组(P<0.05)。Transwell结果显示,肿瘤细胞侵袭能力为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05)。结论miR-10b过表达可激活mTOR蛋白,增加P70S6K活性,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响

目的:探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激体外培养的足细胞24 h建立模型。细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)检测不同浓度雷公藤作用下PAN损伤足细胞的细胞存活率。后将足细胞随机分组:(1)对照组;(2)PAN组(PAN组,PAN 50μg/ml);(3)TP组(PAN 50μg/ml+TP 10 ng/ml),予以相应刺激24 h。采用实时荧光定量PCR检测足细胞m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt、synaptopodin mRNA表达量,western blot检测足细胞p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K、p-Akt、synaptopodin蛋白表达量。结果:(1)CCK-8结果显示,PAN造成足细胞损伤时加入浓度为3、10 ng/ml雷公藤甲素浓度均使足细胞活性上升,10 ng/ml时作用最明显(均P<0.05)。(2)PAN增加m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达量,减少synaptopodin mRNA及蛋白表达水平(均P<0.05)。(3)雷公藤甲素共处理细胞后,m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达水平明显下降,而synaptopodin mRNA及蛋白表达水平明显升高(均P<0.05)。结论:雷公藤甲素可能通过抑制m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路,减轻足细胞损伤。

mTOR/p70S6K通路在缺氧/复氧诱导的分化后PC12神经细胞凋亡中的作用

目的探讨缺氧/复氧(H/R)诱导的分化后肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)凋亡与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)通路的关系。方法实验分为正常对照(Con)组、H/R组、H/R+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、H/R+雷帕霉素(Rapa)组、NAC组及Rapa组。应用MTT法检测细胞活性,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率,用活性氧试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)生成,Western blot检测Bax、Bcl-2、p-mTOR(Ser2448)及p-p70S6K(Thr389)的表达。结果H/R诱导分化后PC12神经细胞凋亡,Bax表达增加,Bcl-2表达降低,NAC或Rapa显著抑制H/R所致的细胞凋亡,逆转Bax及Bcl-2表达的变化;H/R增加分化后PC12神经细胞内ROS水平,NAC显著抑制H/R所致细胞内ROS水平的增加,而Rapa对细胞内ROS水平无明显影响;H/R增加分化后PC12神经细胞p-mTOR(Ser2448)及p-p70S6K(Thr389)的表达,NAC或Rapa显著抑制H/R所致细胞p-mTOR(Ser2448)及p-p70S6K(Thr389)表达的增加。结论H/R可能通过升高细胞内ROS水平,进而激活mTOR/p70S6K信号通路,诱导分化后PC12神经细胞凋亡。

木瓜总三萜通过调节miR-10a和PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导胃癌细胞凋亡

目的:通过观察木瓜总三萜对人胃癌HGC-27细胞株生长的抑制作用,探寻其可能的作用机制。方法:将HGC-27细胞分别单用木瓜总三萜或同转染miR-10a mimic、PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂CCI-779及分别与木瓜总三萜联用处理后,采用MTT和JC-1法检测细胞活性和线粒体活性,实时定量PCR法检测miR-10a mRNA表达,Western blot法检测HGC-27细胞中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白表达及其磷酸化。结果:木瓜总三萜可显著降低HGC-27细胞活性和线粒体活性,促进细胞凋亡;上调miR-10a mRNA表达,下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达及降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K比值(P<0.05)。结论:木瓜总三萜具有抑制人胃癌HGC-27细胞线粒体活性和细胞增殖的作用,其机制可能与促进miR-10a表达,抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路激活有关。

mTOR/p70s6k通路与运动诱导的肌肉蛋白质合成

肌肉运动可以激活一些生长因子,这些生长因子是肌肉蛋白质合成的有力刺激物。mTOR信号转导通路通过增加特异性mRNA的翻译从而在不同水平上控制蛋白质合成,mTOR是被其上游信号PI3K和Akt所激活的,最后在力学负荷过载的情况下激活其效应子p70s6k。运动经由PI3K/Akt/mTOR/p70s6k信号转导通路能有效刺激肌肉合成代谢信号分子的激活。虽然对磷脂酸、整联蛋白的研究已经取得了一定的进展,但是还有一些问题需要进一步研究,特别是其与mTOR信号转导通路的关系。由于不同的运动模式对于mTOR/p70s6k信号通路的影响是不一样的,因此更详细地了解不同运动模型的类型、强度和时间,有利于更好地了解mTOR/p70s6k信号转导通路。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。

中药肝复康对肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的干预作用

目的观察中药肝复康含药血清对乙醛刺激的肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的影响,以探讨肝复康抗纤维化的分子生物学机制。方法体外培养大鼠HSC-T6细胞,用肝复康对乙醛刺激的HSCs进行干预,采用RT-PCR法测定HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K的表达。结果空白对照组肝星状细胞各指标表达量呈相对较低水平,乙醛刺激组细胞Ⅰ型胶原、mTOR、P70S6K和Ⅲ型胶原表达量明显升高(P<0.05),而肝复康干预对于细胞Ⅰ型胶原、mTOR和P70S6K的升高有明显的抑制作用(P<0.01)。结论 mTOR/P70S6K信号通路在HSCs活化过程中起到重要作用,肝复康发挥抗纤维化的作用机制与阻断mTOR/P70S6K信号通路有关。

原发性胆囊癌组织中mTOR/p70S6K信号通路的表达及其临床病理学意义

目的探讨mTOR/p70S6K信号通路在原发性胆囊癌组织中的表达和临床意义。方法随机选取原发性胆囊癌患者86例,慢性胆囊炎患者15例,采用SABC免疫组化方法,检测胆囊癌组织和慢性胆囊炎症组织中mTOR及p70S6K蛋白的表达情况。并分析其与原发性胆囊癌组织临床病理学特征之间的关系。结果mTOR及p70S6K蛋白在原发性胆囊癌组织中的阳性表达率分别为77.91%(67/86)及80.23%(69/86),显著高于两者在慢性胆囊炎组织中的阳性表达率。两者在原发性胆囊癌组织中的表达呈正相关(r=0.791,P<0.01)。mTOR及p70S6K蛋白的阳性表达率与胆囊癌组织的分化程度、Nevin分期和淋巴结转移密切相关(均P<0.05),而与肿瘤直径、患者性别无明显关系。结论mTOR/p70S6K信号通路的特异性激活可能在原发性胆囊癌的发生、浸润、转移中起重要作用。

mTOR/P70S6K/HIF-1α信号通路在脂多糖诱导Caco-2细胞屏障损伤中的作用及机制

目的:探讨缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Caco-2细胞屏障损伤中的作用,并探究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)/P70核糖体蛋白S6激酶(P70 ribosomal protein S6 kinase,P70S6K)信号通路的调控机制。方法:实验分成两部分,第一部分通过使用HIF-1α激活剂、抑制剂分别处理LPS作用的Caco-2细胞,探讨HIF-1α在LPS诱导的Caco-2细胞屏障损伤中的作用;第二部分则分别采用mTOR抑制剂、激活剂与HIF-1α激活剂、抑制剂联合处理LPS作用的Caco-2细胞,探讨HIF-1α影响LPS诱导的Caco-2细胞屏障损伤的分子机制。分别采用ERS-2电阻仪测量跨膜电阻,荧光法测量荧光右旋糖苷(FD4)浓度,Western blot检测HIF-1α、p-mTOR、p-P70S6K和紧密连接结构蛋白(ZO-1、occludin及claudin-1)的表达。结果:LPS诱导Caco-2细胞损伤,表现为跨上皮细胞电阻值(transepithelial cell resistance,TEER)降低,FD4浓度上升;HIF-1α激活剂DMOG可增加LPS作用的Caco-2细胞TEER、降低FD4浓度,同时上调HIF-1α和紧密连接结构蛋白的表达(P<0.05),而HIF-1α抑制剂BAY87-2243的作用则与DMOG作用相反;mTOR抑制剂雷帕霉素可降低LPS作用的Caco-2细胞TEER、增加FD4浓度,同时下调p-mTOR、p-P70S6K、HIF-1α及紧密连接结构蛋白的表达(P<0.05),而mTOR激活剂MHY1485则可增加LPS作用的Caco-2细胞TEER、降低FD4浓度,上调Caco-2细胞中p-mTOR和p-P70S6K表达水平(P<0.05),但不影响HIF-1α和紧密连接结构蛋白的表达水平。在雷帕霉素基础上加入DMOG,雷帕霉素对LPS处理的Caco-2细胞的效应被逆转;而在MHY1487基础上加入BAY87-2243,MHY1487对LPS处理的Caco-2细胞的效应被逆转。结论:HIF-1α可减轻LPS诱导的Caco-2细胞屏障损伤,其作用受mTOR/P70S6K信号通路调节。

下调Ets2表达对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的:探讨下调Ets2表达对裸鼠Eca109移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响。方法:选择已筛选出的在体外靶向下调Ets2基因表达的siRNA片段,构建包含此片段的慢病毒(LV-siE ts2)并感染Eca109,15只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和LV-siE ts2组,分别背部皮下接种Eca109、LV感染的Eca109和LV-siE ts2感染的Eca109,形成移植瘤,之后观察肿瘤生长情况、绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率。应用qRT-PCR检测肿瘤组织中Ets2 mRNA的表达,TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡,Western blot法检测肿瘤组织中Ets2、Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin以及mTOR/p70S6K信号通路蛋白的表达。结果:LV-siE ts2组肿瘤生长速度明显变慢,肿瘤体积和质量显著小于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);LV-siE ts2组肿瘤组织中Ets2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低;LV-siE ts2能引起Eca109细胞的凋亡,且上调Caspase-3和E-cadherin蛋白表达水平,而下调Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05);LV-siE ts2能显著降低mTOR及p70S6K的蛋白表达。结论:LV-siE ts2在体内通过抑制mTOR/p70S6K信号通路促进细胞凋亡,从而抑制裸鼠Eca109移植瘤的生长。

mTOR/P70S6K信号通路活化在肝硬化门静脉高压症中意义的实验研究

目的探讨mTOR/P70S6K信号通路在早期肝硬化门静脉高压症中的活化状态,证实mTOR信号通路的激活参与肝硬化门静脉高压症的发病,并探讨其可能机制。方法本实验采用胆道结扎离断制备大鼠肝硬化门静脉高压症模型。雄性SD大鼠20只随机分为假手术组和模型组。通过组织病理学、形态学和血流动力学评估肝纤维化、炎症、和门静脉压力。采用RT-PCR和Western blot法分别测定肝纤维化标志物PC-αI、α-SMA、TGFβ1及PDGF基因的转录和mTOR信号通路标志物P70S6K和磷酸化的P70S6K(P-P70S6K)的表达。结果模型组大鼠胆道结扎离断3周后,P-P70S6K表达量明显增高而总蛋白P70S6K无显著差异,同时HSCs和胆管细胞活化增殖显著,肝脏促纤维化基因明显上调,间质胶原合成增加。结论mTOR/P70S6K信号通路主要以磷酸化功能状态参与肝硬化门静脉高压症的形成,阻断该通路可能成为肝硬化门静脉高压症治疗的新靶向。