苓桂术甘汤对心梗后慢性心衰大鼠线粒体分裂-融合及Sirt3/AMPK信号通路的影响

目的:探讨苓桂术甘汤对心肌梗死(MI)后慢性心力衰竭(CHF)大鼠线粒体分裂-融合及沉默信息调节因子3(Sirt3)/单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组(生理盐水,仅穿线不结扎)、模型组(生理盐水,结扎冠状动脉左前降支近心端)、苓桂术甘汤组(4.2 g·kg^(-1))、卡托普利组(0.00257 g·kg^(-1)),每组10只,连续给药28 d。彩色多普勒超声成像仪检测大鼠心功能参数变化;苏木素-伊红(HE)染色观察心脏病理学改变;免疫荧光法检测活性氧(ROS)水平;JC-1法检测线粒体膜电位;比色法检测三磷酸腺苷(ATP)水平、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ);原位末端标记法(TUNEL)染色检测心肌组织细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sirt3、磷酸化(p)-AMPK、磷酸化动力相关蛋白1(p-Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、线粒体分裂因子(MFF)、视神经萎缩蛋白1(OPA1)蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)显著升高(P<0.01),左室短轴缩短率(LVFS)、左室射血分数(LVEF)显著降低(P<0.01);心肌组织出现炎性细胞浸润,病理损伤明显,ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01),SOD水平、ATP含量、膜电位显著降低(P<0.01);线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ)显著降低(P<0.01);p-Drp1、Fis1、MFF蛋白水平显著上调(P<0.01),Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白水平显著下调(P<0.01)。与模型组比较,苓桂术甘汤组与卡托普利组LVIDd和LVIDs显著降低(P<0.01),LVEF和LVFS显著升高(P<0.01),心肌组织炎性细胞浸润与病理损伤明显减轻,ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01),SOD水平、ATP含量、膜电位显著升高(P<0.01);线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ)显著升高(P<0.01);p-Drp1、Fis1、MFF蛋白表达显著下调(P<0.01),Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:苓桂术甘汤可缓解心肌细胞氧化应激与细胞凋亡损伤,改善线粒体功能,其作用可能与线粒体分裂-融合、Sirt3/AMPK信号通路有关。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

风咳汤通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路减轻咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎症

目的探讨风咳汤对咳嗽变异性哮喘(CVA)大鼠气道炎症及肺功能的改善作用及机制。方法采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝混合物1 mL皮下注射致敏后再以雾化的OVA激发哮喘建立CVA大鼠模型,分别给予风咳汤低剂量、高剂量和地塞米松进行治疗,正常对照组与模型组灌胃相应体积生理盐水。Diff-Quick法进行肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数,ELISA法检测各组大鼠BALF上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-22(IL-22)含量;观察大鼠肺组织病理学变化;检测大鼠肺组织中SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路中的相关蛋白和基因表达水平;检测肝组织中Caspase-1的活性。结果与正常组比较,模型组大鼠炎症细胞数量、炎症因子含量和HE染色显示的病理改变都显著升高,SIRT1表达水平下降,NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平和mRNA水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,风咳汤高剂量可以显著降低炎症细胞数和炎症因子含量,改善肺组织的病理改变,升高SIRT1的表达水平同时降低NF-κB、NLRP3、ASC和IL-1β的蛋白水平及mRNA水平,其作用与地塞米松相当。此外,风咳汤还可以降低Caspase-1的活性。结论风咳汤可以通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路有效改善CVA大鼠气道炎症,改善肺功能。

栀子苷调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺损伤的影响

目的:探讨栀子苷(GE)通过调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/核因子κB(NF-κB)信号通路对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺损伤的影响。方法:通过气管滴注脂多糖(LPS)方法建立ARDS大鼠模型。将建模后的50只大鼠随机分为ARDS组、GE低剂量(GE-L,12.5 mg/kg GE)组、GE中剂量(GE-M,25 mg/kg GE)组、GE高剂量(GE-H,50 mg/kg GE)组、GE-H+Compound C(AMPK抑制剂,50 mg/kg GE+250μg/kg Compound C)组,另取10只正常大鼠为对照组。干预后,分别取出各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织,检测肺湿干重比(W/D);ELISA法检测BALF中炎症因子IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;免疫组化法检测肺组织中血管细胞黏附因子(VCAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)阳性表达;HE染色观察肺组织病理变化;Western blot检测肺组织中AMPK/SIRT1/NF-κB通路蛋白表达水平。结果:ARDS组W/D、IFN-γ、IL-6、TNF-α水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、VCAM-1表达较对照组显著升高,p-AMPK/AMPK、SIRT1、VEGF表达显著降低(P<0.05);经不同剂量GE治疗后,W/D、IFN-γ、IL-6、TNF-α水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、VCAM-1表达较ARDS组逐渐降低;p-AMPK/AMPK、SIRT1、VEGF表达逐渐升高(P<0.05);Compound C逆转了GE-H组对ARDS大鼠的保护作用(P<0.05)。结论:GE可以改善ARDS大鼠肺损伤状况,降低炎症因子水平,可能与激活AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路有关。

原花青素通过SIRT1/AMPK信号通路对庆大霉素致大鼠急性肾损伤的改善机制

目的探究原花青素对庆大霉素致大鼠急性肾损伤(AKI)的改善机制。方法通过腹腔注射硫酸庆大霉素构建AKI大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、盐酸贝那普利5 mg/kg组(阳性对照)、原花青素50 mg/kg组、原花青素100 mg/kg组、原花青素200 mg/kg组,每组10只;另取10只正常大鼠作为正常对照组。各给药组大鼠灌胃相应药液,正常对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积生理盐水。所有大鼠每天给药1次,连续28 d。末次给药后,检测血清中血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及24 h尿液中尿蛋白(UP)水平;计算肾脏指数;观察大鼠肾组织病理变化并进行病理评分;检测肾组织细胞凋亡率和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤2基因相关X蛋白(Bax)表达水平,以及沉默信息调节因子1(SIRT1)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)蛋白的磷酸化水平。结果与模型对照组比较,各给药组大鼠SCr、BUN、UP、MDA水平,肾脏指数,肾组织病理评分,肾组织细胞凋亡率及肾组织中Caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著降低,SOD、GSH-Px水平和肾组织中SIRT1、AMPK蛋白的磷酸化水平均显著升高(P<0.05),且原花青素的作用存在剂量依赖性(P<0.05);原花青素200 mg/kg组与盐酸贝那普利5 mg/kg组比较,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论原花青素对AKI大鼠的改善作用可能与其激活SIRT1/AMPK信号通路进而抑制氧化应激有关。

虫草菌丝调节AMPK/SirT1信号通路对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的作用

目的研究虫草菌丝(cultured mycelium Cordyceps sinensis,CMCS)对四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化模型小鼠肝腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1(AMPK/SirT1)信号通路的作用机制。方法将C57BL/6小鼠(n=40)按体重分层随机分为5组:正常对照组、CMCS对照组(3.0 g/kg)、模型对照组、CMCS 1.5 g/kg组(1.5 g/kg)和CMCS 3.0 g/kg组(3.0 g/kg),采用腹腔注射10%CCl4(2 mL/kg)诱导小鼠肝损伤模型。造模与给药2周后,检测血清ALT、AST、TBil水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肝炎症;天狼星红染色观察肝胶原沉积;Jamall’s法检测肝羟脯氨酸(Hyp)含量;流式蛋白定量技术(cytometric bead array,CBA)检测肝组织IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-10、IL-12p70水平;免疫组化观察肝组织CollagenⅠ和SirT1表达情况;RT-qPCR检测肝组织Prkaa1、Prkaa2、Lkb1和p53水平。结果CCl4染毒2周后,模型对照组血清ALT、AST、TBil水平均明显升高(P<0.05);HE染色和天狼星红染色分别提示肝内大量炎症细胞浸润和胶原沉积;肝Hyp含量及IL-6、MCP-1、TNF表达明显增多(P<0.05),IL-10和IL-12p70表达明显减少(P<0.01);免疫组化染色提示肝组织Collagen I表达增多;SirT1在肝窦间隙表达减少,在胶原沉积处表达增多;RT-qPCR检测提示肝组织Prkaa1、Prkaa2、Lkb1表达下降,p53表达增多(P<0.05)。CMCS可显著降低纤维化小鼠血清ALT、AST水平;降低肝组织IL-6、MCP-1、TNF表达(P<0.05),上调IL-10、IL-12p70水平(P<0.05);减少肝炎细胞浸润、胶原形成和Hyp含量,促进肝窦内SirT1表达,上调肝Prkaa1、Prkaa2、Lkb1表达(P<0.05);减轻肝内CollagenⅠ、p53表达(P<0.05)。与CMCS 1.5 g/kg组相比,CMCS 3.0 g/kg组抑制肝炎症、胶原沉积及上调AMPK/SirT1表达更为明显(P<0.05)。结论CMCS可通过上调AMPK/SirT1信号通路而发挥抗CCl4诱导小鼠肝纤维化的作用。

车叶草苷调节SIRT1/AMPK信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠氧化应激损伤的影响

目的探究车叶草苷(asperuloside,ASP)调节沉默信息调节因子-1(SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氧化应激损伤的影响。方法随机选取12只大鼠作为对照组(Control组),其余采用香烟暴露诱导建立COPD大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组(Model组)、车叶草苷低剂量组[ASP-L,14 mg/(kg·d)ASP]、中剂量组[ASP-M,28 mg/(kg·d)ASP]、高剂量组[ASP-H,56 mg/(kg·d)ASP]、车叶草苷高剂量+SIRT1抑制剂组[ASP-H+EX527组,56 mg/(kg·d)ASP+4.38 mg/(kg·d)EX527],每组12只。测量大鼠的肺功能及肺湿干质量比(W/D);酶联免疫吸附测定(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;TUNEL检测肺组织凋亡情况;免疫组织化学检测抗髓过氧化物酶(MPO)表达;免疫印迹法检测SIRT1/AMPK信号通路相关蛋白表达。结果COPD大鼠成功建模,与Model组相比,ASP-L组、ASP-M组、ASP-H组大鼠气道阻力(RI)、W/D比值、细胞凋亡率、MDA、ROS水平、MPO光密度值降低(P<0.05),吸气流量峰值(PIF)、呼气流量峰值(PEF)、第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)比值、SOD、GSH-Px水平及SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表达升高(P<0.05);HE染色结果显示ASP干预后COPD大鼠肺组织炎性浸润及肺组织结构变化减轻;EX527可减弱ASP-H对COPD大鼠肺组织损伤的改善作用。结论ASP可能通过激活SIRT1/AMPK信号通路,抑制肺组织氧化应激和细胞凋亡,改善COPD大鼠肺功能。

强记汤通过激活AMPKα/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻D-半乳糖诱导的认知损伤和线粒体功能障碍

目的:探讨强记汤对D-半乳糖诱导的线粒体功能障碍的作用及其机制。方法:80只C57BL/6小鼠被随机分配至空白组、模型组、二甲双胍组和强记汤组。对空白组以外的其他3组小鼠背颈部皮下注射D-半乳糖(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),连续8周,以建立衰老相关的认知损伤模型。强记汤组给予强记汤水煎液(24.96 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,二甲双胍组给予二甲双胍(0.2 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水(20 mL·kg^(-1)·d^(-1)),连续灌胃4周,每天1次。Morris水迷宫实验和新物体识别实验评估小鼠的学习记忆力;Fluoro-Jade B(FJB)染色观察海马区受损的神经元;透射电镜观察海马区线粒体的超微结构;试剂盒检测活性氧(ROS)水平;JC-1染色检测海马神经细胞线粒体膜电位水平;试剂盒检测海马组织线粒体ATP及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ含量;Western blot检测海马组织中AMP活化蛋白激酶α(AMPKα)、第172位苏氨酸磷酸化的AMPKα(p-AMPKα-Thr172)、沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、NRF2和线粒体转录因子A(TFAM)水平。结果:Morris水迷宫实验和新物体识别实验结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05或P<0.01),穿越平台次数、目标象限驻留时间及新物体识别指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。FJB染色结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马CA1和CA3区FJB标记的神经元数量显著减少(P<0.05或P<0.01)。透射电镜显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞中线粒体损伤减轻,且线粒体的长度和面积显著增加(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞中ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。JC-1染色结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞线粒体膜电位显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马组织线粒体ATP及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。Western blot结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马p-AMPKα-Thr172、SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2和TFAM水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:强记汤可通过激活AMPKα/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻D-半乳糖诱导的认知障碍、神经元损伤及线粒体功能障碍。

基于SIRT3/AMPK通路探讨齐墩果酸对病毒性心肌炎小鼠炎症及纤维化损伤的影响

目的探究齐墩果酸对病毒性心肌炎(VMC)小鼠炎症及纤维化损伤的影响。方法采用腹腔注射柯萨奇B3病毒(CVB3)构建VMC小鼠模型,并随机分为模型组、齐墩果酸组、SIRT3抑制剂(3-TYP)组、齐墩果酸+3-TYP组,每组15只;另取15只小鼠作为正常组,各组给予相应药物处理7d。采用超声心动图检测心功能,ELISA法检测血清心肌损伤标志物[肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI)]、炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)]水平,流式细胞术检测外周血辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)比例以评价免疫功能,HE、Masson及TUNEL染色观察心肌组织炎症、纤维化、凋亡等病理损伤,免疫荧光法、免疫组化法分别检测心肌组织SIRT3、转化生长因子-β(TGF-β)阳性表达,蛋白印迹法检测SIRT3/AMPK通路及下游相关蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠饮食减少,萎靡、耸毛、弓背蜷缩行为增多,出现死亡,心肌细胞病理损伤严重,心率、左心室射血分数、心肌组织SIRT3阳性表达、SIRT3、p-AMPK/AMPK蛋白表达降低(P<0.05),左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径、血清CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6水平、外周血Th17/Treg比例、心肌胶原容积分数、心肌细胞凋亡率、TGF-β阳性表达、p-NF-κB/NF-κB、Bax、TGF-β、p-Smad3/Smad3、α-SMA、FN蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,齐墩果酸可缓解小鼠VMC病理症状,上调SIRT3/AMPK通路相关蛋白表达(P<0.05),下调其介导的炎症、凋亡、纤维化反应(P<0.05),而3-TYP可逆转齐墩果酸的上述作用(P<0.05)。结论齐墩果酸可能通过激活SIRT3/AMPK通路,抑制CVB3感染引起的VMC小鼠心肌组织炎症、凋亡及纤维化反应,从而改善VMC小鼠心功能。

高良姜素调节SIRT1/AMPK/mTOR信号通路对脂多糖诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨高良姜素调节沉默信息调节因子1(SIRT1)/增强腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法将大鼠关节软骨细胞分为对照组,模型组(1.0μg·mL^(-1)LPS),高良姜素低(1.0μg·mL^(-1)LPS+10μmol·L^(-1)高良姜素)、中(1.0μg·mL^(-1)LPS+20μmol·L^(-1)高良姜素)、高(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素)剂量组,高良姜素高剂量+EX527(SIRT1抑制剂)组(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素+40μmol·L^(-1)EX527)。用流式细胞术检测关节软骨细胞凋亡;丹酰尸胺(MDC)染色观察关节软骨细胞自噬;酶联免疫吸附法检测细胞中白细胞介素1β(IL^(-1)β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6水平;Western Blot法检测苄氯素(Beclin)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、SIRT1、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、mTOR、p-mTOR表达情况。结果与对照组比较,模型组MDC阳性细胞比例,Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均降低(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值均升高(P<0.05)。与模型组比,高良姜素低、中、高剂量组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均增加(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达及p-mTOR/mTOR比值均降低(P<0.05)。与高良姜素高剂量组比较,高良姜素高剂量+EX527组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达以及p-AMPK/AMPK比值明显降低(P<0.05),细胞凋亡率IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值明显升高(P<0.05)。结论高良姜素能促进LPS诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,可能是通过激活SIRT1/AMPK/mTOR信号通路发挥作用。

基于网络药理学研究大补元煎防治AD的作用机制及AMPK/SIRT1信号通路验证

目的:通过网络药理学和分子对接技术探究大补元煎防治阿尔茨海默病(AD)的作用机制,并利用动物实验验证所发现的分子机制。方法:网络药理学分析大补元煎抗AD的有效成分及作用靶点。利用AutoDock和PyMOL软件对药物的核心成分与核心蛋白进行分子对接验证。AD模型小鼠给予大补元煎治疗,并验证所发现的核心通路。结果:共筛选出80个有效活性成分和107个疾病作用靶点。大补元煎治疗AD的作用靶点有95个,其中核心靶点有35个。GO富集发现主要涉及程序性细胞死亡过程、细胞凋亡和信号转导调节等。KEGG信号通路富集发现主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路、Wnt信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等。Morris水迷宫实验显示,大补元煎可减少AD小鼠的平台潜伏期,并增加小鼠的穿越平台次数和目标象限时间。免疫组化实验(IHC)结果显示,大补元煎可增加AD小鼠海马CA3区神经元核抗原(NeuN)标记的阳性细胞数。免疫荧光(IF)结果显示,大补元煎可抑制AD小鼠海马CA3区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、离子钙结合蛋白1(IBA1)的表达水平。Western blot实验显示,大补元煎可增加AD小鼠海马中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)和沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达水平。结论:本研究探讨了大补元煎抗AD的作用机制,并发现大补元煎可通过激活AMPK/SIRT1信号通路改善AD认知损伤、神经元丢失和神经炎症。

基于SIRT1/AMPK信号通路探究壮宣饮对H1N1肺炎小鼠肺泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的:基于沉默信息调节因子1(silencing information regulator 1,SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine activated monophosphate protein kinase,AMPK)信号通路探究壮宣饮对H1N1肺炎小鼠肺泡上皮细胞自噬和凋亡的影响。方法:随机选择6只小鼠作为对照组,其余小鼠通过鼻内滴入100μL甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)[A/PuertoRico/8/34(PR8,H1N1)病毒]溶液建立H1N1肺炎小鼠模型。将造模成功小鼠随机平分为H1N1组、低-壮宣饮组(7.16 g·kg^(-1))、中-壮宣饮组(14.33 g·kg^(-1))、高-壮宣饮组(28.66 g·kg^(-1))、高-壮宣饮+Compound C组(28.66 g·kg^(-1)壮宣饮+0.25 mg·kg^(-1) SIRT1/AMPK信号通路抑制剂Compound C),每组均6只,每天上、下午各1次,连续5天,H1N1组和对照组给予等量生理盐水。ELISA法检测BALF中炎性因子水平;HE染色检测肺组织病理变化;分离和培养小鼠肺泡上皮细胞;流式细胞术检测肺泡上皮细胞凋亡;Western blot检测肺泡上皮细胞自噬蛋白、SIRT1/AMPK信号通路相关蛋白表达。结果:对照组肺组织结构正常,而H1N1组肺组织炎性细胞浸润到间质中、肺泡严重出血、塌陷、间质水肿、肺泡壁增厚,H1N1组较对照组γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平、肺泡上皮细胞凋亡率显著升高(P<0.05),AMPK、SIRT1蛋白水平、微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ/Ⅰ、苄氯素1(benzyl chloride 1,Beclin 1)蛋白水平显著下降(P<0.05);与H1N1组相比,低-壮宣饮组、中-壮宣饮组、高-壮宣饮组IFN-γ、IL-6、TNF-α水平、肺泡上皮细胞凋亡率显著下降(P<0.05),AMPK、SIRT1蛋白水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白水平显著升高(P<0.05),且呈剂量相关性。Compound C逆转了高-壮宣饮的有利影响。结论:壮宣饮可能通过调控SIRT1/AMPK信号通路对H1N1肺炎小鼠肺泡上皮细胞自噬和凋亡起到改善作用。

半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路对甲减模型大鼠脂质代谢异常的保护作用

目的探讨半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路,改善甲减模型大鼠脂质代谢异常的作用及其机制。方法60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、优甲乐组、半硫丸低剂量组、半硫丸高剂量组、联合用药组,每组10只,除正常组外,其余各组大鼠灌胃给予10 mg/kg丙硫氧嘧啶4周制备甲减模型,造模成功后干预6周,ELISA法检测血清甲状腺功能及血脂水平,RT-qPCR法检测肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达,Western Blot法检测肾周脂肪组织TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清FT3、FT4降低(P<0.01),TSH、TG、TC、LDL-C水平升高(P<0.01),肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达以及TSHR、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达升高(P<0.01),p-AMPK蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠血清TC、LDL-C水平降低(P<0.01),优甲乐组和联合用药组TG水平降低(P<0.01),半硫丸各组肾周脂肪组织PPARγmRNA表达以及TSHR、PPARγ蛋白表达降低(P<0.01),p-AMPK蛋白表达升高(P<0.01),各给药组GPAT_(3)mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论半硫丸可能通过调控TSHR介导的AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路改善甲减导致的脂质紊乱,这种机制与优甲乐不同。

LncRNA MINCR调控AMPK/SIRT1信号通路对LPS诱导的人肺泡上皮细胞自噬和炎症反应的作用机制

目的探讨lncRNA MINCR调控AMPK/SIRT1信号通路对LPS诱导的人肺泡上皮细胞自噬和炎症反应的作用机制。方法将A549细胞随机分为Control组(A549细胞正常培养)、LPS组(10μg/mL LPS处理A549)、si-NC组(转染si-NC质粒后,10μg/mL LPS处理A549)、si-MINCR组(转染si-MINCR质粒后,10μg/mL LPS处理A549)和si-MINCR+Compound C组(转染si-MINCR质粒后,10μg/mL LPS和50μmol/L的Compound C处理A549)。qRT-PCR检测细胞中MINCR相对表达量,CCK-8和流式细胞仪检测细胞存活率和凋亡率,ELISA检测细胞中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平,蛋白质印迹法检测细胞中LC3、p62、Beclin-1、AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表达。结果与Control组比较,LPS组细胞中MINCR相对表达量(3.84±0.52)、细胞凋亡率(26.84%±3.12%)、细胞中IL-6(416.95±45.06)、IL-8(549.32±61.45)、TNF-α(694.81±71.42)水平及细胞中p62蛋白(0.87±0.10)表达明显升高,细胞中LC3Ⅱ/LC3Ι比值(0.32±0.05)、p-AMPK/AMPK比值(0.31±0.05)、Beclin-1(0.52±0.07)和SIRT1蛋白(0.46±0.06)表达明显降低(P<0.01);与LPS组比较,si-MINCR组细胞中MINCR相对表达量(1.45±0.26)、细胞凋亡率(9.62%±1.15%)、细胞中IL-6(198.62±21.34)、IL-8(287.15±30.76)、TNF-α(364.72±40.59)水平及细胞中p62蛋白(0.87±0.10)表达明显降低,LC3Ⅱ/LC3Ι比值(0.78±0.09)、p-AMPK/AMPK比值(0.64±0.07)、Beclin-1(0.73±0.08)和SIRT1蛋白(0.81±0.09)表达明显增加(P<0.01);与si-MINCR组比较,si-MINCR+Compound C组细胞中MINCR相对表达量(3.21±0.45)、细胞凋亡率(20.24%±2.26%)、细胞中IL-6(395.78±10.47)、IL-8(543.26±56.71)、TNF-α水平(610.54±65.33)及细胞中p62蛋白(0.79±0.08)表达明显升高,细胞中LC3Ⅱ/LC3Ι比值(0.40±0.06)、p-AMPK/AMPK比值(0.38±0.04)、Beclin-1(0.56±0.06)和SIRT1(0.52±0.07)蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论敲减lncRNA MINCR可促进LPS诱导的肺泡上皮细胞自噬,减轻炎性损伤,其作用机制可能与激活AMPK/SIRT1信号通路有关。

槲皮素调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路抑制C2C12细胞凋亡

目的:基于AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路探讨槲皮素对C2C12细胞增殖、成肌分化和凋亡的影响。方法:体外培养C2C12细胞进行成肌诱导,分别采用CCK8法(Cell Counting Kit-8)、ATP染色法及TUNEL法检测槲皮素对C2C12细胞增殖活力、成肌能力和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,筛选合适浓度。再采用合适浓度的槲皮素或AKT1通路抑制剂(LY294002)干预成肌诱导后的C2C12细胞,ATP法和TUNEL法分别检测C2C12细胞成肌能力和凋亡水平,Western blot检测p-AKT1、p-AMPK和p-Foxo3a蛋白表达水平。结果:①在一定范围内,槲皮素呈浓度依赖性促进C2C12增殖,12.5μmol/L的槲皮素显著促进C2C12细胞成肌分化,能显著提高成肌标志物MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,因此本研究选择12.5μmol/L的槲皮素用于后续研究。②10μmol/L LY294002显著抑制C2C12细胞成肌分化,促进细胞凋亡,抑制p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,促进p-Foxo3a蛋白表达;12.5μmol/L槲皮素联合10μmol/L LY294002显著促进C2C12细胞成肌分化,抑制细胞凋亡,促进p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,抑制p-Foxo3a蛋白表达。结论:槲皮素通过调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路的磷酸化促进C2C12细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

林西替尼(OSI-906)通过AMPK/SIRT3信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌肥大

目的:基于AMP活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子3(SIRT3)信号通路,探讨林西替尼(OSI-906)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的小鼠心肌肥大的作用及其作用机制。方法:采用随机数字表法将30只C57BL/6J小鼠分为对照组、模型组(Ang Ⅱ组)和OSI-906干预组(Ang Ⅱ+OSI-906组),每组10只。皮下注射Ang Ⅱ(2 mg·kg^(-1)·d^(-1))诱导小鼠心肌肥大,持续2周;OSI-906干预组在此基础上给予OSI-906(50 mg/kg)灌胃,持续2周。采用HE染色评价小鼠心脏组织病理学改变;RT-qPCR和Western blot检测小鼠心脏组织相关mRNA和蛋白表达水平;ELISA法检测心脏组织氧化应激指标丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。结果:与模型组相比,OSI-906治疗后小鼠心脏重量指数显著降低(P<0.05);小鼠心脏组织病理损伤减轻;小鼠心肌肥大标志标志物心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)及炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6的mRNA水平均显著下调(P<0.05);MDA水平表达下调(P<0.01),SOD、CAT和GSH-Px的表达水平升高(P<0.05),且磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和SIRT3蛋白表达上调(P<0.05)。在细胞水平,使用AMPK信号的阻断剂Compound C干预新生小鼠心室肌细胞后,心肌细胞的ANP、BNP、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达水平显著上调。结论:OSI-906可显著抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠心肌炎症和氧化应激反应,并可能通过激活AMPK/SIRT3信号通路发挥抗心肌肥大的作用。

AMPK/Sirt1信号通路在运动调控骨骼肌质量中的作用

Sarcopenia指随着年龄的增加,机体骨骼肌质量、力量及功能逐渐下降的现象,它的发生增加了老年人的健康维护成本,给家庭及社会带来沉重经济负担。Sarcopenia的病理生理过程非常复杂,涉及细胞凋亡、氧化应激、蛋白质合成减少、骨骼肌废用、炎症反应、线粒体功能障碍等,并与骨骼肌质量控制(蛋白质质量控制和肌纤维数目控制)失衡密切相关。AMPK(AMP-activated protein kinase)、Sirt1(silencing information reg-ulator1)是机体内重要的能量代谢感受器,可感知体内的能量代谢状态,通过改变下游分子的基因表达或活性调节机体能量代谢过程。AMPK/Sirt1信号通路通过对细胞自噬、细胞凋亡、细胞增殖与分化、骨骼肌蛋白合成与降解、炎症反应等过程对的调控影响骨骼肌质量与功能,这可能与机体衰老过程中Sarcopenia的发生、发展及转归密切相关。研究表明,运动可促进骨骼肌蛋白质合成、增加机体的瘦体重,达到预防和治疗Sarcopenia的目的,但运动所引起的AMPK/Sirt1信号通路及其调控下游细胞事件的适应性改变与Sarcopenia的内在联系尚不明确。本文通过对AMPK/Sirt1信号通路与骨骼肌蛋白合成、降解和细胞凋亡等信号通路的关系及其运动调控进行综述,以期深入了解运动、AMPK/Sirt1信号通路与Sarcopenia的内在关系,旨为Sarcopenia的运动防治提供新思路。

2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的改变及Sirt1的调控机制研究

目的检测Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在糖尿病大鼠心肌及高糖培养的H9C2细胞中的表达变化,明确其在糖尿病心肌病发生发展中的作用。方法高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,实验将大鼠分为糖尿病2周、4周、8周模型组和对照组,超声心动图检测大鼠心功能变化,Western blot检测大鼠心肌Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1蛋白表达变化。将H9C2细胞分为正常对照组、DMSO组(78.12 mmol·L^(-1))、高糖(HG)组(33 mmol·L^(-1))、白藜芦醇(Res)组(20μmol·L^(-1))、尼克酰胺(Nam)组(40 mmol·L^(-1)),Western blot及qRT-PCR研究心肌细胞Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1相关蛋白基因转录及表达,研究Sirt1对该信号通路的调控机制。结果在动物实验中,与2周DM大鼠比较,8周DM大鼠心肌Sirt1蛋白表达明显增加。2周模型组大鼠相对于正常对照组心肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1表达明显增加,且S6K1表达4周模型组比2周模型组增加更明显,但8周表达降低。在高糖培养的H9C2细胞中,与对照组相比,高糖组Sirt1,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达明显增高。Nam处理组Sirt1表达明显降低,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达增高。Res处理组Sirt1表达明显增高,而PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达降低。结论 Sirt1通过负调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与糖尿病心肌损伤,参与早期糖尿病心肌病的发生发展。

白藜芦醇通过Mst1/Sirt3信号通路介导的细胞自噬改善糖尿病心肌损伤的机制研究

目的:观察白藜芦醇(Resveratrol)对2型糖尿病模型小鼠心肌细胞损伤及其对Mst1/Sirt3信号通路介导的细胞自噬的影响。方法:C57BL/KSJ db/db小鼠随机分为小鼠模型组、Resveratrol组及西药组,C57BL/KSJ db/m为空白对照组,每组10只。Resveratrol组和西药组分别给予白藜芦醇和二甲双胍灌胃治疗,空白组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃治疗,连续8周。分别采用H&E染色、透射电镜和免疫荧光法观察心肌组织病理形态、超微结构和细胞凋亡水平,RT-qPCR法检测心肌组织凋亡基因Bax和Bcl-2的表达水平,Western-blot法检测心肌组织中自噬蛋白(LC3和p62)、Mst1和Sirt3蛋白的表达水平。结果:与模型组相比,Resveratrol能够显著降低db/db小鼠体重、血糖和血清CK和LDH的水平,差异均具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。同时,Resveratrol治疗后心肌炎症评分、凋亡率及心肌组织中Bax mRNA的表达水平及Bax/Bcl-2的比值显著降低,Bcl-2 mRNA的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。此外,与模型组相比,Resveratrol组心肌组织中p62和p-Mst1蛋白的表达水平显著降低,Sirt3蛋白的表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值水平显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:Resveratrol通过激活Mst1/Sirt3信号通路促进心肌细胞自噬水平,抑制心肌细胞凋亡对糖尿病心肌病发挥保护作用。