SIRT3基因在老年膀胱癌组织中表达及对上皮间质转化的影响

目的探讨SIRT3基因在老年膀胱癌组织中的表达及对上皮间质转化(EMT)的影响。方法经病理档案室收集行手术切除的膀胱癌患者癌组织标本及配对癌旁正常组织108例,免疫组化染色法和Western印迹法检测膀胱组织SIRT3及EMT标志蛋白E-钙黏素(E-cadherin)、Snail、Slug表达率和表达量,分析SIRT3表达与膀胱癌临床病理特征的关系。购自上海北诺生物科技有限公司的30株人膀胱癌UMUC3-141细胞分为空白组(不作任何处理)、对照组(转染空白SIRT3质粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3组(转染SIRT3质粒pcDNA3.1-Sirt3)各10株,分别采用CCK8法、Transwell小室侵袭实验、划痕实验检测转染后癌细胞增殖、侵袭和转移能力;Western印迹法检测癌组织SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表达,免疫荧光法观察癌细胞形态学变化,明确SIRT3基因与EMT的关系。结果膀胱癌组织中SIRT3、E-cadherin表达量和阳性表达率明显低于癌旁正常组织(P<0.05),Snail、Slug表达量和阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。SIRT3与E-cadherin呈正相关而与Snail、Slug呈负相关(P<0.05);SIRT3表达与年龄、肿瘤直径、肿瘤分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。转染SIRT3后,癌细胞增殖、侵袭、转移能力减弱;SIRT3、E-cadherin表达增强而Snail、Slug表达减弱;免疫荧光结果显示,UMUC3-141细胞形态呈典型EMT形态学改变。结论SIRT3在膀胱癌中呈低表达,低水平SIRT3可促进膀胱癌发生;过表达SIRT3可抑制EMT发生而抑制膀胱癌发生和进展。

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。

Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达

目的构建Sirt3基因过表达慢病毒载体,通过稳定感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立Sirt3基因过表达的SH-SY5Y细胞株,为研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用提供新的方法。方法从GenBank中检索Sirt3基因序列,根据此序列设计并合成人Sirt3基因引物,扩增Sirt3基因的cDNA片段,将其克隆至慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin中,构建慢病毒表达质粒。采用聚合酶链反应方法对阳性克隆进行鉴定和测序分析。将重组过表达病毒质粒及其2种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定病毒滴度。取对数生长期SH-SY5Y细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和Sirt3组,空白对照组SH-SY5Y细胞仅加入普通培养基,阴性对照组SH-SY5Y细胞转染阴性对照病毒,Sirt3组SH-SY5Y细胞转染Sirt3过表达慢病毒。转染后加入嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞。使用实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blot检测各组细胞中Sirt3mRNA和蛋白相对表达量。结果成功扩增Sirt3基因片段,大小1242bp;测序分析结果显示,过表达慢病毒Sirt3与GenBank中Sirt3基因序列完全一致,病毒滴度为1.2×10^12TU·L^-1。Sirt3组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);空白对照组与阴性对照组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Sirt3基因过表达慢病毒载体可成功构建,并获得稳定表达Sirt3基因的SH-SY5Y细胞株。

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P<0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。

Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的构建

目的构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,建立Sirt3基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞株。方法从Genbank中检索到Sirt3基因序列,根据此序列设计Sirt3基因的4条siRNA干序列和1条阴性对照序列,将它们分别与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的线性化慢病毒载体连接,获得4种重组慢病毒质粒。将4种重组的干扰病毒质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度。将4种构建的慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测Sirt3的沉默效果,筛选出最有效干扰Sirt3基因表达组。结果测序证实成功构建了4种Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,病毒滴度分别为:LV-SIRT3-RNAi-18×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-23×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-38×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-48×10^8 TU/mL。与空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)相比,LV-Sirt3-RNAi-3组mRNA表达水平及蛋白表达水平显著下降(P<0.001,P<0.001)。结论成功构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,并筛选出最佳干扰序列组,获得稳定沉默Sirt3表达的SH-SY5Y细胞株,为后续研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用奠定了基础。

合作猪SIRT 3基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆合作猪沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,SIRT3)基因CDS区序列,并对其进行生物信息学分析,探究SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平,为研究SIRT 3基因功能奠定基础。【方法】试验选择3月龄合作猪公猪3头,采集心脏、睾丸、肺脏等组织,采用PCR扩增、Sanger测序等方法获取SIRT 3基因CDS区序列,并通过Mega 7.0软件构建系统进化树;通过生物信息学在线软件分析SIRT3蛋白结构和功能;采用实时荧光定量PCR检测SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达量。【结果】合作猪SIRT 3基因CDS区长774 bp,共编码257个氨基酸。系统进化树结果显示,合作猪与家猪亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SIRT3蛋白的分子质量为28.68 ku,理论等电点为5.81,不稳定系数为37.92,为稳定性亲水蛋白;该蛋白不存在跨膜区域,无信号肽,但存在2个低复杂度结构域,主要分布于内质网中;SIRT3蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构模型预测结果与二级结构基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT 3基因在合作猪不同组织中均有表达,在心脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),其次是睾丸、肺脏、肝脏组织。【结论】本研究成功克隆合作猪SIRT 3基因CDS区序列,探究了SIRT 3基因在合作猪不同组织中的表达水平并初步分析了其编码蛋白的生物学功能,为进一步研究合作猪SIRT 3基因功能提供了参考。

SIRT3基因多态性与猪肉质性状的关联分析

为了探索SIRT3基因多态性与猪肉质性状的关联性,通过引物设计、PeR扩增、测序以及酶切分型,对SIRT3基因的突变位点进行检测和分析,确定了SIRT3基因的三种基因型,并将SIRT3基因的三种基因型与湘村黑猪、大围子猪的肉质性状进行了关联分析。结果表明:在猪SIRT3基因的第五外显子上存在一处A/G突变位点,形成AA、AG和GG三种基因型。进行猪SIRT3基因多态性分析可知,GG基因型频率和等位基因频率在两猪种中占有绝对优势,且在湘村黑猪中并未检测出AA基因型突变个体;进行猪SIRT3基因突变位点遗传多样性分析可知,湘村黑猪的多态信息含量(PIC)小于0.25,为低度多态,大围子猪的PIC含量在0.25~0.50之间,为中度多态。进行基因多态性与猪肉质性状的关联分析,在大围子猪24小时滴水损失、失水率和肌内脂肪含量三个性状中,AA基因型与AG、GG基因型相比差异显著(P<0.05);而湘村黑猪仅有肌肉色值中的亮度值(L^*值)在各基因型之间存在显著性差异(P<0.05),其余性状之间并不存在差异显著性(P>0.05)。由此得出,SIRT3基因突变基因型可以提高猪肉品质,SIRT3基因可作为影响猪肉质性状的候选基因进行深入研究分析。

SIRT3基因与代谢综合征及心肌肥厚的相关性研究

SIRT3基因作为沉默信息调节因子2（Sirtuin）家族中的一员，主要定位于线粒体内膜，具有强大的去乙酰基作用，不仅参与调节能量代谢、细胞凋亡、肿瘤生长、抗衰老等活动，在心血管方面也发挥重要的作用。本文主要就SIRT3在代谢综合征及心肌肥厚方面的研究进展进行综述，为进一步探讨SIRT3在心血管疾病中的潜在作用提供理论依据。