流体切应力下SIVA-1凋亡诱导因子促成骨细胞增殖分化的双向调节作用

目的探讨流体切应力(fluid shear stress,FSS)对KM小鼠成骨细胞增殖分化及相关细胞凋亡诱导因子(SIVA-1)的调节作用。方法将传至3代成骨细胞分为应力刺激组(试验组)和非应力刺激组(对照组)。5个试验组分别给予1.2PaFSS作用0.25,0.5,1,2,4h;对照组为0h。MTT法测定细胞增殖,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,半定量RT-PCR测定凋亡诱导因子SIVA-1的表达水平。结果FSS促增殖作用在短期(0.25,0.5h)明显,且细胞生长曲线前移;但在1,2,4h却有明显抑制增殖作用。FSS同样增加了ALP活性,尤其在应力作用0.5h时显著(ALP含量为2.4320±0.205金氏单位/100ml,相对对照达158%)(P<0.05);而应力作用1,2,4h后减低了ALP的表达。应力初期SIVA-1mRNA表达量明显下降,尤其在FSS作用0.5h后SIVA-1/GAPDH相对表达量为0.099±0.002,相对对照明显下调了71.3%(P<0.01),此效应在作用1h后减退,SIVA-1mRNA表达开始升高,4h后升高明显。结论1.2PaFSS在短时间刺激下可刺激成骨细胞增殖分化,尤其在0.5h后效应明显。早期促细胞增殖和ALP水平升高主要与SIVA-1mRNA表达下调有关,而后期抑制作用可能与SIVA-1mRNA表达升高有关。

利拉鲁肽通过抑制线粒体依赖性凋亡及缺氧诱导因子1α表达对脊髓损伤的保护作用

探究利拉鲁对脊髓损伤的保护作用及其相关机制。方法 选取18只SD大鼠,分为三组,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,分别为对照组、应用等量生理盐水及利拉鲁肽组,每组6只,检测大鼠的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、凋亡相关因子配体(FASL)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、细胞色素c(Cyt-c)、Caspase3、Smac/Diablo,以及凋亡相关蛋白指标,对大鼠的下肢运动功能进行评估。结果 检测结果显示,利拉鲁肽对Caspase3、TNF-α、FASL、HIF-1α、P53、Cyt-c、Smac/Diablo有明显的抑制作用,并且能够逆转凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。利拉鲁肽应用14d后,大鼠的下肢运功功能出现明显改善。结论 利拉鲁肽对脊髓损伤有保护作用,可以抑制线粒体依赖性凋亡,以及缺氧诱导因子1α表达,从而发挥显著的效果。

miR-660-3p靶向NFAM1对RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的影响

目的探讨微小RNA-660-3p(miR-660-3p)靶向具有ITAM基序1的NFAT活化蛋白(NFAM1)对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌的影响。方法体外传代培养人支气管上皮细胞16HBE。取对数生长期16HBE细胞,随机分为对照组、RSV组、miR-660-3p+RSV组、miR-NC+RSV组、pcDNA-NC+RSV组、pcDNA-NFAM1+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组,miR-NC+RSV组转染NC mimics,miR-660-3p+RSV组转染miR-660-3p mimics,pcDNA-NFAM1+RSV组转染pcDNA-NFAM1,pcDNA-NC+RSV组转染pcDNA-NC,miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组共转染pcDNA-NC和miR-660-3p mimics,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组共转染pcDNA-NFAM1和miR-660-3p mimics,对照组和RSV组不予转染;除对照组外,其余各组均予RSV感染,MOI设定为0.0001。收集各组细胞,采用RT-qPCR法检测miR-660-3p、NFAM1 mRNA表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测Cleaved-Caspase-3、NFAM1蛋白表达;收集各组培养上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。通过starBase数据库预测NFAM1与miR-660-3p的靶向结合位点,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-660-3p与NFAM1的靶向调控关系。结果与对照组比较,RSV组miR-660-3p表达降低,NFAM1 mRNA与蛋白及Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高,细胞凋亡率及培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。与miR-NC+RSV组比较,miR-660-3p+RSV组miR-660-3p表达升高,Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P均<0.05)。与pcDNA-NC+RSV组比较,pcDNA-NFAM1+RSV组NFAM1 mRNA、Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。经starBase数据库预测,NFAM1的3′非翻译区存在与miR-660-3p的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相较于共转染NC mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞荧光素酶活性下降(P<0.05);相较于共转染NC mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞荧光素酶活性变化不明显(P>0.05)。与miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组比较,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。结论miR-660-3p可通过靶向负调控NFAM1抑制RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌。

可溶性肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子在斑秃病人血清及皮损中的表达及临床意义

目的检测可溶性肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子(sTWEAK)在斑秃病人血清及皮损中的表达水平,并探讨其在斑秃发病过程中的作用及临床意义。方法以2017年10月至2018年11月在首都医科大学附属北京友谊医院确诊并治疗的斑秃病人70例为斑秃组,依据病情分为轻症组(44例)、重症组(26例)。同期该院因色素痣或皮肤良性肿瘤进行头皮手术的人群65例作为对照组。比较各组sTWEAK及相关细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)蛋白及mRNA表达水平;采用Pearson法分析两指标间相关性。多元线性回归分析各指标与sTWEAK或脱发严重度工具(SALT)评分的关系。结果斑秃组血清及皮损中sTWEAK表达水平[(196.73±32.48)ng/L,(2.35±0.62)ng/L]高于对照组[(121.75±19.62)ng/L,(1.49±0.45)ng/L](P<0.05)。斑秃组血清及皮损中细胞因子IL-12、IFN-γ表达水平高于对照组(P<0.05),IL-4表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。斑秃病人血清及皮损中sTWEAK表达水平与IL-12及IFN-γ呈正相关,与IL-4表达水平无明显相关性。轻症组血清及皮损中sTWEAK[(173.25±26.84)ng/L,(2.04±0.57)ng/L]、IL-12及IFN-γ表达水平低于重症组[(236.47±42.02)ng/L,(2.87±0.70)ng/L](P<0.05);轻症组、重症组血清及皮损中IL-4表达水平差异无统计学意义(P>0.05);斑秃病人血清、皮损处sTWEAK、IL-12、IFN-γ与SALT评分均呈正相关(P<0.05)。多元线性回归分析显示,IL-12、IFN-γ与血清和皮损处sTWEAK呈显著正相关;血清及皮损处sTWEAK、IL-12、IFN-γ与SALT评分存在正相关性(P<0.05)。结论斑秃病人血清及皮损中sTWEAK表达水平增加,与IL-12及IFN-γ呈正相关,sTWEAK、IL-12及IFN-γ均与斑秃病情严重程度密切相关,sTWEAK可能参与斑秃炎症反应过程。

瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

凋亡诱导因子基因敲减对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景:众多基础与临床试验证实:骨髓间充质干细胞移植后的低存活率严重制约着其发挥长期的治疗效果。课题组前期研究发现凋亡相关因子在骨髓间充质干细胞凋亡过程中发挥了重要作用,其中凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白可能是其中一个关键因子。目的:将AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至小鼠梗死心肌中,验证低AIF表达骨髓间充质干细胞移植后的存活情况以及对进一步改善心功能的重要性。方法:首先,通过LV-AIF-shRNA慢病毒感染骨髓间充质干细胞下调AIF蛋白表达,应用流式细胞术及Western blot、RT-qPCR检测慢病毒的感染效率,CCK-8检测AIF敲减骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的细胞活力;然后,构建急性心肌梗死小鼠模型,分别将正常及AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至心肌梗死区域,免疫荧光检测AIF蛋白的表达,ELISA检测血清脑钠尿肽水平,心脏超声检测心功能,Masson染色观察心肌纤维化情况,RT-qPCR检测AIF敲减骨髓间充质干细胞移植后SRY基因表达反映细胞存活情况。结果与结论:①LV-AIF-shRNA慢病毒感染成功构建AIF基因敲减的骨髓间充质干细胞,感染效率为97.7%,且AIF表达有显著下降(P<0.001);②在缺血缺氧培养状态下,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞较正常骨髓间充质干细胞的细胞活力显著增加;③与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后在梗死心肌中的存活数目显著升高至3.71倍(P<0.001),并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达、心肌纤维化程度;④与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后血清脑钠尿肽水平显著降低(P<0.05),左室射血分数、左室缩短分数均有显著改善(P<0.05);⑤结果表明:AIF基因敲减可通过增强骨髓间充质干细胞移植后的细胞活力、增加骨髓间充质干细胞在供体内的存活从而减少心肌纤维化,改善急性心肌梗死后心功能。

Y-box结合蛋白1通过沉默信息调节因子1 mRNA稳定性调节抑制人颗粒细胞凋亡在早发性卵巢功能不全中的作用与机制

目的:探讨Y-box结合蛋白1(YBX1)调节沉默信息调节因子1(SIRT1)对颗粒细胞增殖和凋亡的影响,研究YBX1和SIRT1在早发性卵巢功能不全(POI)患者及卵巢功能正常患者间表达水平差异及临床意义。方法:留取2022年6月至2023年7月于江苏大学第四附属医院生殖医学中心进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的POI患者(POI组)及卵巢储备功能正常患者(对照组)的颗粒细胞和血清,利用免疫印迹(WB)检测YBX1蛋白表达水平;利用实时荧光定量核酸扩增法(RT-qPCR)检测YBX1及SIRT1 mRNA表达水平,并分析血清中其与卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_(2))、抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡数(AFC)的相关性;利用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)、细胞计数试剂8(CCK8)检测细胞增殖、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;RT-qPCR检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况;RNA免疫沉淀(RIP)实验检测YBX1与SIRT1的相互作用。结果:与对照组患者相比,POI组患者颗粒细胞和血清中YBX1蛋白及SIRT1 mRNA的表达降低(P<0.05);血清中YBX1、SIRT1 mRNA表达与FSH、LH负相关(r<0,P<0.05),与E_(2)、AMH、AFC正相关(r>0,P<0.05);在颗粒细胞中上调YBX1后SIRT1蛋白表达量、SIRT1 mRNA的稳定性、EdU阳性率、细胞活性、PCNA mRNA表达量、Bcl2/BAX比值均增加(P<0.05),Caspase-3 mRNA表达量、TUNEL阳性率均降低(P<0.05)。结论:YBX1和SIRT1在POI患者中表达水平显著下调,且其表达水平与临床卵巢功能指标相关;YBX1结合SIRT1 mRNA增强其稳定性,可能促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示YBX1和SIRT1有望成为POI诊疗的新靶点。

X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

虎杖苷调控Janus激酶1/信号传导和转录激活因子3信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤作用实验研究

目的:探讨研究虎杖苷调控Janus激酶1(JAK1)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法:选取人宫颈癌HeLa细胞株,分为对照组(未经任何处理的HeLa细胞)、虎杖苷低、中、高剂量组(加入50、100、150μmol/L虎杖苷),继续培养24、48、72 h, Annexin V双染法检测HeLa细胞凋亡,MTT检测HeLa细胞增殖能力,Transwell小室检测HeLa细胞侵袭能力,qRT-PCR检测JAK1、STAT3 mRNA表达,Western blot检测JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达,并进行细胞形态学观察。结果:与对照组比较,虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞凋亡率升高,高剂量组凋亡率高于中剂量组,中剂量组高于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞增殖和侵袭能力显著下降,虎杖苷高剂量组增殖率和侵袭细胞数最低(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞中JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达显著下降,高剂量组JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达低于中剂量组,中剂量组低于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组小鼠肿瘤体积缩小,肿瘤质量降低(均P<0.05)。结论:虎杖苷可诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制其增殖、迁移、侵袭及裸鼠皮下成瘤,其作用机制可能与调控JAK1/STAT3通路信号通路有关。

CCAT1靶向抑制miR-375-3p通过线粒体途径诱导的人口腔癌SAS细胞凋亡

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)靶向miR-375-3p通过线粒体途径诱导人口腔癌SAS细胞凋亡的作用。方法:人口腔癌SAS细胞随机分为空白组、CCAT1下调组、CCAT1上调组、CCAT1下调对照组、CCAT1上调对照组、miR-375-3p下调组、miR-375-3p上调组、miR-375-3p下调对照组和miR-375-3p上调对照组。转染48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-375-3p表达、线粒体凋亡通路相关的基因半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶9(caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达;免疫印迹检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达;双荧光素酶报告实验分析CCAT1与miR-375-3p的靶向关系。结果:与空白组和CCAT1下调对照组比较,CCAT1下调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低;与空白组和CCAT1上调对照组比,CCAT1上调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表达升高;与空白组和miR-375-3p下调对照组比较,miR-375-3p下调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表达升高;与空白组和miR-375-3p上调对照组比较,miR-375-3p上调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低。双荧光素酶实验结果提示CCAT1可靶向调控miR-375-3p。结论:CCAT1可抑制人口腔癌SAS细胞凋亡,推测是通过靶向抑制miR-375-3p的表达,调控线粒体凋亡通路相关基因及蛋白的表达来实现的。

血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、半乳凝素3、摄食抑制因子-1与慢性阻塞性肺疾病合并抑郁的相关性分析

目的探讨血清中可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(s TRAIL)、半乳凝素3、摄食抑制因子-1与慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并抑郁的相关性。方法选取2019年7月至2021年5月河北北方学院附属第一医院收治的COPD急性加重期住院患者173例,其中单纯COPD组103例,COPD合并抑郁组70例,记录并比较两组临床资料及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1水平。采用logistic回归模型分析COPD合并抑郁的影响因素,进一步绘制受试者操作特征(ROC)曲线评估预测效能。结果COPD合并抑郁组COPD评估测试评分、治疗依从性差占比、合并慢性病占比、独居占比及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1水平均高于单纯COPD组,第1秒用力呼气量占用力肺活量百分率(FEV_(1)/FVC)、第1秒用力呼气容积占预计值百分率(FEV_(1)pred)、职工医疗保险占比均低于单纯COPD组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素分析结果显示,FEV_(1)/FVC、FEV_(1)pred、治疗依从性、医疗保险类型及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1均为COPD合并抑郁的影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1三者单独及联合均对COPD合并抑郁有一定的预测价值(P<0.05)。结论COPD患者发生抑郁与多种因素有关,血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1联合检测对COPD患者合并抑郁诊断有一定价值。

苦豆碱通过调控miR-210对脂多糖致心肌细胞凋亡及炎性因子表达的影响

目的:探讨苦豆碱对脂多糖(LPS)致心肌细胞凋亡和炎症反应的影响。方法:将大鼠心肌H9c2细胞分为NC组(不作任何处理)、LPS组、LPS+苦豆碱低剂量组、LPS+苦豆碱中剂量组、LPS+苦豆碱高剂量组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-210组、LPS+苦豆碱中剂量组+anti-miR-NC组、LPS+苦豆碱中剂量组+anti-miR-210组。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、流式细胞术、蛋白免疫印迹法检测细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测miR-210表达水平。结果:不同浓度苦豆碱处理后,LPS处理的心肌细胞活性及Ki-67、Bcl-2、miR-210蛋白表达水平增加,细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平降低,IL-1β、TNF-α水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。过表达miR-210后LPS处理的心肌细胞活性、Ki-67、Bcl-2表达水平增加,细胞凋亡率及p21、Bax表达水平降低,IL-1β、TNF-α水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰miR-210表达能逆转苦豆碱对LPS诱导的H9c2细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响。结论:苦豆碱可通过上调miR-210抑制LPS致心肌细胞凋亡和炎症反应。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与肿瘤放射治疗

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2L),是肿瘤坏死因子(TNF)超家族中的新成员,通过与受体结合而选择性地诱导肿瘤细胞、转化细胞及病毒感染的细胞发生程序性死亡。TRAIL在选择性地诱导肿瘤细胞凋亡同时对正常组织细胞无毒副作用。研究发现,联合药物治疗或者放射治疗可以增强TRAIL对肿瘤细胞诱导凋亡的敏感性,因此目前受到国内外学者的普遍关注。本文以TRAIL与放射治疗的联合应用为切入点进行论述,以期理解其在肿瘤放射治疗中的作用。

缺氧诱导因子-1α通过调控MDA和SOD抑制急性缺血性脑卒中小胶质细胞焦亡的体外实验研究

目的体外实验探究缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)调控丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)对急性期缺血性脑卒中小胶质细胞(BV2)焦亡的调节作用及机制。方法构建小胶质细胞急性期氧糖剥夺复氧模型(OGD/R),应用CCK-8法确定模型最佳干预时机。对HIF-1α进行稳定剂GF-4592过表达和HIF-1α小分子干扰RNA(HIF-1α-siRNA)抑制表达,分为空白组(A组)、OGD/R模型组(B组)、OGD/R+FG-4592干预组(C组)、OGD/R+siRNA阴性对照组(D组)、OGD/R+HIF-1α-siRNA组(E组)。通过CCK-8法检测5组细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞焦亡情况。ELISA检测MDA、SOD、细胞上清IL-18、IL-1β水平。Western blot法检测不同组HIF-1α、GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平。结果确定缺氧6 h复氧12 h为最佳干预时间。与B组和D组比较,C组细胞增殖升高,细胞焦亡降低,MAD、SOD、IL-18、IL-1β水平显著降低,GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3靶蛋白的表达水平明显降低(P<0.05);而E组细胞增殖降低,细胞焦亡增加,MAD、SOD、IL-18,IL-1β,GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3靶蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论HIF-1α因子能有效调控小胶质细胞焦亡。HIF-1α可能通过调控MDA和SOD抑制急性缺血性脑卒中小胶质细胞焦亡。

姜酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法:培养HT22细胞,设置不同OGD/R时间梯度,建立OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+1μmol·L^(-1)姜酮组、OGD/R+10μmol·L^(-1)姜酮、OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组和OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理4 h后予以OGD 8 h和复糖复氧8 h处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10μmol·L^(-1)ML385预处理6 h,CCK-8法检测各组细胞活性,Western blotting法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,HT22细胞经OGD 8 h和复糖复糖8 h处理后细胞存活率低于50%,以OGD 8 h和复糖复糖8 h建立HT22细胞OGD/R模型。与OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组细胞存活率升高最明显(P<0.01),故选用100μmol·L^(-1)姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.05)。结论:姜酮可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用。

过表达核凋亡诱导因子1增强鼻咽癌细胞放射敏感性

目的探究核凋亡诱导因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1,NAIF1)对鼻咽癌细胞CNE-2R放射敏感性的影响。方法采用Western blot检测NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2R的表达水平。通过慢病毒感染技术将NAIF1过表达慢病毒(LV-NAIF1组)及其阴性对照慢病毒(LV-NC组)分别感染CNE-2R细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测NAIF1的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8、克隆形成实验分别检测各组细胞在不同照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射下的增殖能力、克隆形成能力并计算相应的存活分数,采用流式细胞术实验检测各组细胞6 Gy照射前后的细胞周期分布情况。结果与CNE-2细胞相比,NAIF1在CNE-2R细胞中的蛋白表达水平显著降低(P<0.001)。与LV-NC组相比,LV-NAIF1组CNE-2R细胞中NAIF1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.001)。经不同剂量照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可以抑制CNE-2R细胞的增殖能力(均P<0.05),降低CNE-2R细胞的克隆形成数和存活分数(P<0.05)。经6 Gy照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可使更多的CNE-2R细胞滞留在G2/M期(P<0.01)。结论NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2R中低表达,过表达NAIF1可能通过抑制细胞增殖并将细胞周期阻滞在G2/M期,从而增强鼻咽癌细胞CNE-2R的放射敏感性。

氨调控宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1α表达对线粒体细胞凋亡及嫩度的影响

为探究氨介导宰后牦牛肉中低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达对线粒体细胞凋亡及肌肉嫩度的影响。以10 mmol/L氯化铵(NH_(4)Cl)、0.9%生理盐水(对照)和10 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)3种溶液处理的牦牛背最长肌为研究对象,通过测定HIF-1α表达量、NO含量、能量代谢酶活力、ATP水平、细胞凋亡线粒体途径及肌肉嫩度等相关指标,探讨宰后牦牛肉细胞凋亡与嫩度变化的机制,完善宰后牦牛肉成熟过程中细胞凋亡与嫩度变化理论体系。结果表明:在宰后牦牛肉成熟过程,各处理组HIF-1α表达量、NO含量总体呈现先增加后减少趋势,Na^(+)-K^(+)-ATPase与Ca^(2+)-ATPase活力、细胞凋亡酶9(Caspase-9)与细胞凋亡酶3(Caspase-3)活力和剪切力呈现先升高后降低的趋势。ATP含量、线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放程度、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)及肌纤维直径和面积随成熟时间延长呈现逐渐下降趋势,而肌原纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)与肌细胞间隙呈现逐渐增大趋势。宰后6~24 h,NH_(4)Cl组HIF-1α表达量和NO含量显著高于对照组(P<0.05),L-NAME组显著低于对照组(P<0.05)。宰后6~72 h,NH_(4)Cl组ATP含量显著高于对照组与L-NAME组。宰后6~24 h,对照组Na^(+)-K^(+)-ATPase、Ca^(2+)-ATPase活力显著高于NH_(4)Cl组(P<0.05),显著低于L-NAME组(P<0.05)。宰后6~120 h,NH_(4)Cl组MPTP开放程度显著小于对照组(P<0.05),L-NAME组显著大于对照组(P<0.05)。宰后0~168 h,NH_(4)Cl组MMP下降47.72%,对照组下降53.54%,L-NAME组下降60.05%。宰后6~72 h,NH_(4)Cl组Caspase-9与Caspase-3活力显著低于对照组(P<0.05),L-NAME组Caspase-9与Caspase-3活力显著高于对照组(P<0.05);宰后6~120 h,NH_(4)Cl组剪切力、肌纤维面积与直径大于对照组,MFI和肌纤维间隙小于对照组,L-NAME组则相反。综上,随着牦牛肉宰后成熟,氨通过上调HIF-1α表达进而使Na^(+)-K^(+)-ATPase与Ca^(2+)-ATPase活力下降、ATP含量增加,从而调控肌细胞能量代谢,维持内环境稳定;通过抑制MPTP开放以及MMP下降,降低Caspase-3/9活力,抑制线粒体细胞凋亡发生,进而引起剪切力增大、MFI减小以及肌细胞形态变化,最终对牦牛肉嫩度产生负面影响。

miR-138靶向HIF-1α介导NLRP3炎症小体对脑卒中大鼠神经元凋亡的影响

目的探究微小RNA(miR)-138对缺氧诱导因子(HIF)-1α和Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3通路的调控作用及对脑卒中大鼠神经元凋亡的影响。方法收集60例脑卒中患者及20例健康体检者血清,qRT-聚合酶链反应(PCR)法检测miR-138表达。中动脉线栓阻塞法建立大鼠脑卒中模型,设置假手术组、模型组、miR-138激动剂(miR-138 agomir)组、agomir-NC组、HIF-1α激活剂组、miR-138 agomir+HIF-1α激活剂组,每组15只。改良神经功能损害程度评分(mNSS)检测神经功能缺损症状;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死面积;尼氏及TUNEL染色法检测神经元损伤及凋亡;免疫组化法检测海马组织M1型巨噬细胞极化表面标志物CD11c、NLRP3阳性表达;Western印迹检测HIF-1α、NLRP3、白细胞介素(IL)-1β、IL-18、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-1、pro-Caspase-1蛋白表达。结果miR-138在脑卒中患者血清中表达较健康者显著降低(P<0.05)。与假手术组相比,模型组海马组织神经元损伤及凋亡加重,促炎表型的巨噬细胞浸润明显(CD11c阳性表达升高),脑梗死面积及神经功能缺损评分升高,miR-138表达降低,HIF-1α活化介导的NLRP3炎症小体活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-138 agomir干预治疗可缓解脑卒中大鼠神经元损伤及凋亡,降低脑梗死面积及神经功能缺损评分,抑制HIF-1α活化介导的NLRP3炎症小体激活发挥的促炎作用,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α激活剂可加重脑卒中大鼠神经元损伤及凋亡,并削弱miR-138 agomir发挥的抗HIF-1α/NLRP3活化、抗炎及抗凋亡作用,差异有统计学意义(P<0.05)。结论上调miR-138表达,可通过抑制HIF-1α介导的NLRP3炎症小体活化,发挥抗脑卒中后神经元凋亡作用。

基于Wnt/β-连环蛋白通路探究金天格对肿瘤坏死因子-α诱导的小鼠MC3T3E1细胞生物学功能的影响实验研究

目的:探讨金天格通过调节Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的小鼠成骨细胞(MC3T3E1)细胞生物学功能的影响。方法:体外培养MC3T3E1细胞,分为对照组、TNF-α组(50 ng/ml TNF-α)、L-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-6) g/L金天格)、M-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10-5 g/L金天格)、H-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格)、Dickkopf-1(DKK-1)组(50 ng/ml TNF-α+10 ng/ml Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK-1)、H-金天格+LiCl组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格+20μmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl)。用CCK-8试剂盒对细胞活性进行检测,用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测,用酶联免疫吸附试验对细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平进行检测,用Western blot对细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况进行检测。结果:与对照组比较,TNF-α组细胞活性、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及B细胞淋巴瘤(Bax)、β-catenin、转录因子7样2(TCF7L2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白表达升高(均P<0.05)。与TNF-α组比较,L-金天格组、M-金天格组、H-金天格组、DKK-1组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达升高,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达降低(均P<0.05)。与H-金天格组比较,H-金天格+LiCl组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达升高(均P<0.05)。结论:金天格可能通过抑制Wnt/β-catenin通路减轻TNF-α诱导的MC3T3E1细胞损伤。

miR-361-3P调控转化生长因子β1诱导成骨细胞凋亡的研究

目的研究人成骨细胞内miR-361-3P对转化生长因子β1(TGF-β1)和细胞凋亡标志分子caspase 3蛋白活性表达的影响,探讨miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨细胞凋亡中的作用机制。方法用miR-361-3p mimic或inhibitor及TGF-β1 siRNA(siTGF-β1)转染人成骨细胞系hFob1.19;RT-qPCR和Western blotting检测caspase 3的变化;CCK-8法检测细胞的增殖和凋亡;荧光素酶基因报告实验检测miR-361-3p和TGF-β1基因的结合情况。结果在hFob1.19细胞内,miR-361-3p mimic显著下调了TGF-β1mRNA表达,同时明显抑制了细胞内的TGF-β1蛋白活性(P<0.05);miR-361-3p mimic作用hFob1.19细胞48 h后,miR-361-3p可明显抑制细胞增殖(P<0.05),导致成骨细胞内caspase 3蛋白活性明显升高(P<0.05),并减少WT-TGF-β1的荧光素酶活性;miR-361-3p inhibitor可增强hFob1.19细胞增殖,抑制细胞内caspase 3蛋白活性,而si-TGF-β1则可明显增强caspase 3活性表达。结论miR-361-3p可能通过抑制TGF-β1负向调控人成骨细胞的增殖并促进其凋亡。